کلونینگ و ارزیابی بیوانفورماتیکی ژن مونودهیدروآسکوربات ردوکتاز (mdhar) در گیاه آلوروپوس لیتورالیس و بررسی بیش بیان آن در گیاه توتون (nicotina tobacum)
چکیده
شوری خاک یکی از مهمترین عوامل غیرزنده، با برهم زدن شرایط مطلوب است که سبب بروز اختلالات متابولیسمی در سلولهای گیاهی، از جمله افزایش تولید انواع گونههای اکسیژن فعال (ros) میگردد .مونودهیدروآسکوربات ردوکتاز (mdhar) یکی از آنزیمهای کلیدی در مسیر گلوتاتیون-آسکوربات است که نقش احیاکنندگی رادیکالهای مونودهیدروآسکوربات را بر عهده دارد. در تحقیق حاضر آنزیم مونودهیدرو آسکوربات ردوکتاز، از گیاه هالوفیت آلوروپوس لیتورالیس (aeluropus littoralis) شناسایی، جداسازی و هم سانهسازی گردید و به گیاه توتون انتقال داده شد. برای این منظور با توجه به اطلاعات در دسترس در پایگاه ncbi، پرایمرهای مناسب طراحی و با روش rt-pcr توالی ژنی مذکور تکثیر و به منظور توالی یابی در وکتور ptz57r/t درون باکتری ای.کلای (dh5α) هم سانهسازی شد. سپس به منظور انتقال به گیاه توتون، با آنزیم pfu دی. ان. آ. پلیمراز تکثیر گردید. پس از الحاق پروموتر و ترمیناتور 35s به ناقل بیانی pgreen0029، توالی ژنی mdhar نیز به این ناقل وارد شد و سازهی نوترکیب به سلولهای اگروباکتریوم نژاد lba4404 ترانسفورم شد و برای تراریختسازی توتون به روش دیسک برگی مورد استفاده قرار گرفت. از گیاهان باززایی شده در محیط انتخابی حاوی آنتیبیوتیک کانامایسین استخراج dna و سپس rna صورت گرفت و آزمونهای pcr و rt-pcr انجام شد. آزمون pcr با dna گیاهان انتخابی نشان داد توالی ژنی mdhar به سلولهای گیاهان تراریخت وارد شده و بیان مستمر این ژن نیز توسط آزمون rt-pcr تأیید شد. بررسیهای بیوانفورماتیکی روی ژن نشان داد که ژن mdhar شامل 1436 جفت باز و فاقد نواحی اینترونی است. مقایسهی توالی به دست آمده با توالیهای سایر mdharهای گیاهی ثبت شده در بانک ژن، بیانگر شباهت بالای این ژن با سایر mdhrهای جدا شده از گیاهان خانوادهی گندمیان بوده که با mdhar سورگم (sorghum bicolor)، بیشترین شباهت را داشت. آنالیز ساختار پروتئینی، بین سلولی بودن و نواحی موتیف pyr-redoxin و sdr را اثبات کرده و نیز بررسی ساختار ثانویه، نشاندهندهی 3/78 درصد ساختار مارپیچ آلفا، 1/41 درصد ساختار چین خورده ی بتا و 6/13 درصد ساختار دور بتا یا دور معکوس بود.