تولید کلون و بررسی بیان توالی همپوشانی از ژن ns۳ ویروس هپاتیت c به‏وسیله سازه بیانی dna

seyed-younes hosseini، farzaneh sabahi، department of virology, faculty of medical sciences, tarbiat modares university, tehran mohamad hossein modarresi، seyed mohammad moazzeni، department of immunology, school of medical sciences, tarbiat modares university, tehran, iran mehdi saberi firoozi، mehrdad ravanshad، department of virology, school of medical sciences, tarbiat modares university, tehran, iran davood mehrabani

چکیده

هدف: هدف تولید یک سازه بیان کننده توالی یک ناحیه همپوشان از ژن ns3 از ویروس ایزوله ایرانی است. مواد و روش‏ها: ابتدا بخش میانی ژن ns3 با روش nested-rt-pcr و با استفاده از سرم بیمار مبتلا به ژنوتیپ 1a ویروس هپاتیت c تکثیر شد. بعد از کلون آن درون ناقل کلونینگ ta و غربالگری کلون‏ها براساس روش سفید- آبی و colony-pcr این کلون‏های منتخب با روش تعیین توالی و هضم آنزیمی با bglii ارزیابی شد. توالی جدید با استفاده از نرم‏افزار با توالی‏های دیگر مرجع مقایسه و درخت تکاملی ترسیم شد. بخش میانی ژن ns3 تأیید شده و سپس به درون سازه بیانی، کلون شد و کلون‏های مناسب با استفاده از دو نوع colony-pcr شناسایی شد. ارزیابی نهایی بیان ژن با مشاهده gfp توسط میکروسکوپ فلورسانس، روش rt-pcr و وسترن بلات روی سلول‏های ترانسفکت شده با سازه بیانی تأیید شد. نتایج: توالی میانی ns3 از روی سرم بیمار تکثیر و نتایج توالی‏یابی و مقایسه ژنی نشان داد که این توالی به توالی‏های مرجع شباهت داشته و در شاخه ژنوتیپ 1 ویروس هپاتیت c قرار دارد. با روش colony-pcr وجود و نیز جهت ژن درون پلاسمید بیانی تأیید شد. مشاهده gfp توسط میکروسکوپ فلورسانس، روش rt-pcr و وسترن بلات به‏ترتیب نمایانگر انتقال موفق سازه، بیان ژن و نیز تولید پروتئین در سلول‏های 293 بود. نتیجه‏گیری: سازه بیانی حاوی بخش میانی ژن ns3 که بایستی فاقد فعالیت پروتئازی باشد، نسبت به طول کامل ژن ns3 می‏تواند در القای بهتر ایمنی توسط سلول‏های عرضه کننده آنتی ژنی در موارد واکسن ویروس هپاتیت c مفیدتر واقع شود.