استخراج و بهینه سازی تخلیص چند مرحله ای آنزیم تبدیل کننده آنژیوتانسین i(ace) از ریه خرگوش
چکیده
آنزیم تبدیل کننده آنژیوتانسین i(ace) یک پپتیدیل دی پپتید هیدرولاز است که 2 اسید آمینه انتهای کربوکسیلی(his-leu) را از آنژیوتانسین i که یک دکاپپتید است جدا کرده و آنژیوتانسین ii(یک اکتاپپتید) را تولید می نماید. به علت اهمیت ace و مهارکننده های آن در بیماری زایی و درمان بیماری های قلبی عروقی مانند فشار خون بالا و نارسایی قلبی، تخلیص و سنجش آن علاوه بر ارزش علمی دارای اهمیت بالینی و تجاری می باشد. با توجه به این مطلب، در مطالعه حاضر ace از بافت ریه خرگوش به عنوان منبــع غنـی از ace در 3 مرحله خالص گردید. برای استخراج ace، پس از عمل هموژن کردن، از دترژنت غیریونی 40p-nonidet استفاده شد سپس محلول استخراج شــده از دترژنــت، تحــت عمل رسوب دهی با سولفات آمونیوم با غلظت های اشباعی 50% و 70% قرار گرفــت. در مرحلــه بعــد محلول رویی به دست آمده توسط تبادل یونی با q-sepharose hp کروماتوگرافی شد سپس نمونه های دارای حداکثر فعالیت مخصوص آنزیم، توسط 200sepharryl hr s تحت کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون قرار گرفتند. پس از این مرحله خالص بودن آنزیم با sds-page و page تایید شد و وزن مولکولی آن 175 کیلودالتون تعیین گردید. فعالیت مخصوص نهایی به دست آمده برای ace، 1/39 واحد در میلی گرم بود که به دنبال 651 برابر خالص کردن حاصل شده بود و بازده نهایی فرآیند تخلیص، 2/5% مشاهده شد. پس از تخلیص آنزیم، km(michaelis constant) آن برای سوبسترای hhl(هیپوریل ـ هیستیدیل ـ لوسین)، 17/2 میلی مول محاسبه شد. مهار کننــده رقابتــی کاپتوپریــل توانست در غلظت های 1/0 تا 001/0 میلی مولار تقریباً ace را به طور کامل مهار کنــد. ph اپتیمم برای ace 3/8 محاسبه گردید. هم چنین بررسی اثر تغییرات دمایی، کاهش شدیــد در فعالیت آنزیم را در دمای بالاتر از 37 درجه سانتی گراد نشان داد. کاهش مراحل تخلیص و مــدت زمان لازم برای آن و نیز بازده مناسب به دست آمده، نتیجـه استفاده از رزین های با قدرت تفکیــک بهتـر و به کار گیـری سیستم fplc(fast protein liquid chromatography) بود که در نهایت موجب بهبود و کاهش زمان فرآیند تخلیص چند مرحله ای ace گردید.