شناسایی عامل لکه برگی پامچال در استان مازندران با استفاده از توالی ژن های rpod و dnak
چکیده
بیماری لکه برگی ناشی از گونه ای زانتوموناس در پامچال وحشی (primula vulgaris) در چند منطقه جنگلی استان مازندران گزارش شده است (rahimian. 1995. 12th iran. plant protec. cong.,278). براساس یک بررسی ژنومی از تعیین توالی ناحیه its و ژن 16s rrna گزارش گردید که برخی از جدایه های عامل لکه برگی پامچال نزدیک به گونه x.campestris می باشند (rahimian et al. 2008. 18th iran. plant protec. cong.,420)، ولی اطلاع دقیقی از موقعیت تاکسونومیکی این جدایه ها در دسترس نیست. بررسی حاضر به منظور ارزیابی موقعیت تاکسونومیکی جدایههای به دست آمده از چند منطقه جنگلی استان مازندران انجام گرفت. ازکشت نمونه های پامچال دارای علایم لکه برگی، جدایه هایی با کلنیهای محدب زرد رنگ و لعابدار روی محیطnas به دست آمد. واکنش فوق حساسیت پس از تزریق سوسپانسیون باکتری به برگ های شمعدانی بعد از 24 ساعت و بیماری زایی روی برگ های پامچال پس از 7 تا 14 روز به اثبات رسید. نقوش الکتروفورزی پروتئین های سلولی اختلاف چندانی میان جدایه ها نشان نداد. از نظر ویژگیهای فنوتیپی جدایهها بسیار شبیه هم بوده و فقط در مصرف اسید سیتریک به عنوان منبع کربن اختلاف نشان دادند. dna ژنومی جدایه ها استخراج و با به کارگیری آغازگرهای dnakو rpod قطعاتی از این دو ژن با pcr در شرایط توصیه شده پارکینسون و همکاران (parkinson et al. 2007. int. j. syst. evol. microbioi. 57:2881-2887) ولی با کاهش دمای مرحله اتصال (annealing) تکثیر شد. محصول pcr در ژل آگارز 1% الکتروفورز و ژل در محلول ژل رد(gel red) رنگ آمیزی شد. به ترتیب دو قطعه 965 و736 bp از ژن های dnakو rpodتکثیر گردید. به منظور امکان تفکیک محصولpcr جدایه ها از یکدیگر هضم محصول حاصل از تکثیر ژن های dnak وrpodبا آنزیم bamhiصورت گرفت. از ضریب تشابه جاکارد برای تعیین تشابه جدایهها و از روش upgamaو نرم افزار ntsys برای آنالیز خوشهای استفاده شد. نمونههای انتخاب شده براساس نتایج rflp، توالی یابی شد. توالی نوکلئوتیدی به دست آمده، پس از همردیف سازی چندگانه (multiple sequence alignment) با برنامه mega4 با سایر توالی های مربوط به این ناحیه در گونه های مختلف xanthomonas موجود در ژن بانک (ncbi) مقایسه شدند. نتایج به دست آمده نشان داد جدایه ها درسطح تشابه 98% با گونه xanthomonas hortorum شباهت داشته و احتمالاً به پاتوار گزارش نشده ای از این گونه تعلق دارند. این اولین گزارش از جدایه هایی از گونه x.hortorum به عنوان عامل بیماری لکه برگی در پامچال است.