آنالیز سینتیکی و ترمودینامیکی ساختاری rnasea در حضور rna مدیفیکاسیون شیمیائی واحدهای هیستیدین
چکیده
مطالعات سینتیکی و اتصالی آنزیم rnase a در برابر سوبسترای پلیمری rnaو نیز 3-ریبونوکلئوتیدهای آزاد، در محیط بافری تریس edta- (100 میلی مولار تریس؛ ph7/5؛ 2 میلی مولار edta) و در دمای 37 با استفاده از روش طیف نور سنجی افتراقی انجام شده است. منحنی اشباع سنتیکی آنزیم با شکل غیر هیپربولیک خود نمایانگر امکان تبدیل دو ساختار فضائی متفاوت از آنزیم به یکدیگر می باشد که در محدوده بسیار باریکی از غلظت سوبسترا واقع می گردد. در غلظتهای پائین سوبسترا بواسطه میانکنشهای فی ما بین چهار زیرجایگاه موجود در جایگاه فعال آنزیم، تجلی منحنی اشباع سینتیکی آنزیم به شکل یک تابع سیگموئیدی است که خاص سیستم های آنزیمی متعاون با تعاون مثبت می باشد. در غلظتهای بالاتری از سوبسترا، تغییر بنای فضائی آنزیم بهمراه کاهش مشخصی از تعاون مثبت در مقابل افزایش چشمگیر ثابت سرعت کاتالیزوری آنزیم روی می دهد. شکل چند پله ای منحنی اتصالی آنزیم در حضور 3- ریبونوکلئوتیدهای آزاد نشان دهنده وجود چهار زیر جایگاه پیوندی است که سه زیر جایگاه اول جهت اتصال سه بخش از اولین نوکلئوتید متصل شونده به آنزیم (فسفات، ریبوز و باز) اختصاص یافته است و طریقه اتصال با الگوی منظم 3- فسفات ریبوز باز 5 صورت می گیرد. چهارمین زیر جایگاه اتصالی نیز متعلق به دومین گروه فسفات از دومین نوکلئوتید متصل شوند به آنزیم می باشد. ترتیب برای واحدهای نوکلئوتیدی موجود در ساختمان rna برخلاف نحوه اتصال 3- ریبونوکلئوتیدهای آزاد به شکل 5-فسفات ریبوز باز 3 صورت می گیرد. نقش کاتالیزوری و ساختمانی اسیدهای آمینه هیستیدین در پیکره آنزیم ریبونوکلئاز لوزالمعده گاز (rnase a) با استفاده از روشهای مدیفیکاسیون شمیائی واحدهای هیستیدین؛ محاسبه سطح در دسترس اسیدهای آمینه (asa)؛ اسپکتروفلوئورومتری؛ اسپکتروسکوپی uv-cd؛ گرماشنجی رویشی افتراقی (dsc)؛ کروماتوگرافی با کارکرد عالی (hplc) و همچنین سنجش میزان فعالیت آنزیمی در شرایط بافر تریسedta- (100 میلی مولار تریس؛ ph 7/5؛ 2 میلی مولار edta) و دمای 37c بررسی شده است. مطالعات انجام شده نشان می دهد که از چهار واحد هیستیدین موجود در ساختمان آنزیم تنها سه واحد هیستیدین توسط معرف شیمیایی دی اتیل پیروکربنات (depc) مدیفاید می شود و هیستیدین چهارم عملا توسط معرف مذکرو قابل دستیابی نمی باشد. به علت عدم امکان استفاده از روابط و معادلات ترمودینامیکی سیستم های پروتئینی بازگشتی که بر پایه ترمودینامیک تعادلی استوار گشته اند تجزیه و تحلیل منحنیهای واسرشتی حرارتی برای سیستم های پروتئینی غیر بازگشتی نیازمند ارائه معادلات جدیدی می باشد که امکان تفکیک یک منحنی واسرشتی حرارتی را به زیر پیک های سازنده آن فراهم می سازد. در چنین شرایطی میتوان تعداد حد واسطهای موجود در روند واسرشتی حرارتی یک پروتئین را مشخص نمود. در اینجا، پایه گذاری و استفاده از چنین معادلاتی درمورد یک سیستم پروتئینی غیر بازگشتی و چند زیر واحدی نظیر هموگلوبین مشخص ساخته است که این پروتئین، طی واسرشتی حرارتی خود از سه حد واسط پایدار گذر می کند.