جداسازی و تعیین توالی نوکلئوتیدی و کلون کردن ژن آلفا-آمیلا مقاوم به حرارت سویه ای bacillus licheniformis بومی ایران و بیان آن در میزبان escherichia
چکیده
فعالیت a-آمیلازی بسیار مقاوم به حرارت از سویه ای از bacillus licheniformis بومی ایران جدا شده از کارخانجات آرد نواحی کاشان و اطراف دریاچه قم مشخص گردید و به منظور افزایش میزان تولید ژن مربوطه با بکارگیری تکنیک pcr در حضور آغازگرهای طراحی شده بر طبق آنالیز توالیهای موجود در بانکهای اطلاعات ژنی جداسازی گردیده و در پلاسمیدهای حد واسط pyz4 و pbluescript ii ks و پلاسمید بیان کننده pet24d کلون گردید. انتقال کلون اخیر به سلولهای e.coli bl21 (de3) منجر به تولید محصول نوترکیب در حضور iptg و غلظتهای مختلف لاکتور بعنوان ماده القاکننده گردید. پس از تایید فعالیت آنزیمی توسط روش رنگ آمیزی اختصاصی فعالیت بر روی ژل sds-page میزان تولید در دو بخش مجزای درون و بیرون سلولی تعیین گردیده و با استفاده از روشهای سنجش آنزیمی مورد مقایسه قرار گرفت. علاوه بر این با استفاده از روش تعیین توالی اتوماتیک، توالی نوکلئوتیدی ژن مربوطه تعیین گردید. این نتایج بیانگر وجود 1539 جفت باز در این ژن می باشد که پروتئین حاصله از 483 آمینواسید، مشابه با آنچه تاکنون در خصوص این ژن گزارش شده است، تشکیل شده است. مقایسه این توالی نوکلئوتیدی با انواع گزارش شده در بانکهای اطلاعاتی مربوط به سایر سویه های b.licheniformis بیانگر وجود حدود 5/6 درصد تفاوت می باشد که نهایتا 21 مورد تفاوت در محتوای آمینواسیدی را منجر می گردد که نقش ساختمانی پاره ای از تفاوتها مورد بررسی قرار گرفت.