جداسازی و کلون کردن hbeag و ساخت سوش بیانی pichia pastoris برای این آنتی ژن
چکیده
در این پژوهش ژن hbeag از ژنوم کامل hbv سویه ayw با روش pcr جداسازی شد. محصول pcr پس از تخلیص و آنالیز با آنزیم های محدودکننده و انجام مراحل کلونینگ در وکتور puc18 جهت بررسی نهایی به وسیله واکنش های ترادف یابی(sequancing) با تکنیک alf مورد تایید قرار گرفت . در مرحله بعد ژن e آنتی ژن در وکتورهای بیانی phild2 و phils1 که وکتورهای دوسو(shuttle) برای مخمر pichia pastoris و باکتری e.coli می باشند، تحت پروموترaox1، کلون گردید. آنالیزهای آنزیمی صحت ساختار پلاسمید نوترکیب را از لحاظ جهت قرارگیری ژن و ترادف اجزاء واحد بیانی، مورد تایید قرار داد. پلاسمیدهای نوترکیب phild2e و phils1e به صورت خطی (linearized) جهت ترانسفرم کردن p.pastoris با 4 روش ترانسفورماسیون لیتیوم کلراید، 1000 peg ، الکتروپوراسیون و اسفروپلاست بکار رفتند. غربال کلنی های ترانسفرم شده بر روی محیط حداقل، مشاهدات میکروسکوپی، استخراج ژنوم مخمرهای نوترکیب و انجام آنالیز pcr ، ساخت سوش بیانی pichia pastoris برای hbeag را مورد تایید قرار داد. بررسی نتایج روشهای مختلف ترانسفورماسیون نشان داد که اسفروپلاست موثرترین روش ترانسفرم کردن این مخمر می باشد.