انتقال ژن cry3a به یونجه (medicago sativa l) برای ایجاد مقاومت به سرخرطومی یونجه (hypera postica gyll) به کمک اگروباکتریوم
چکیده
یونجه (medicago sativa l.) یکی از گیاهان علوفهای مهم است که به خاطر داشتن پروتئین و ارزش غذایی بالا نقش بسزایی در تغذیه دام دارد. علیرغم فعالیت های مدیریتی بهتر، امروزه آفات بخش قابل توجهی از محصولات کشاورزی (13%) را از بین برده و باعث کاهش کیفیت محصول می شوند. علاوه بر این، سموم مورد استفاده برای کنترل آفات دارای اثرات نامطلوبی بر سلامت انسان و محیط زیست هستند. سرخرطومی یونجه (hypera postica gyll.) آفت مهم یونجه در ایران و جهان است و در ایران خسارت ناشی از این آفت 33% برآورد شده است. این تحقیق به منظور انتقال ژن cry3a به یونجه برای ایجاد مقاومت به آفت سرخرطومی صورت گرفت. با توجه به اینکه اولین گام برای دستکاری ژنتیکی این گیاه، بهینه سازی یک سیستم موثر باززایی درون شیشه ای و بدست آوردن ژنوتیپ هایی با قابلیت باززایی بالا است، ابتدا پاسخ جنین زایی دو جداکشت برگ و دمبرگ پنج رقم یونجه ایرانی با استفاده از شش پروتکل مختلف مورد ارزیابی قرار گرفت. با دو پروتکل iv و vi هر دو جداکشت برگ و دمبرگ کالوس های حاوی جنین سوماتیکی تولید کردند. درصد جنین زایی و تعداد جنین در جداکشت بسته به ژنوتیپ، پروتکل و جداکشت مورد استفاده به ترتیب از صفر تا 12 درصد و صفر تا 5/16 عدد متغیر بود. به منظور گزینش ژنوتیپ های دارای قابلیت جنین زایی بالا، پاسخ جنین زایی 29-21 ژنوتیپ (گیاه) از هر پنج رقم بااستفاده از پروتکل vi مورد ارزیابی قرار گرفت. به طور کلی، 5/10 درصد از ژنوتیپ های مورد ارزیابی قابلیت جنین زایی سوماتیکی را داشتند و سه ژنوتیپ قره یونجه-مراغه-27 (km-27)، قره یونجه-قره قزلو-14 (kk-14) و سینتتیک-18 (syn-18) که قابلیت باززایی بالایی نسبت به بقیه داشتند برای مطالعه بیشتر و بهینه سازی انتقال ژن انتخاب شدند. در این تحقیق، ژن cry3a با استفاده از فناوری dna نوترکیب در ناقل بیانی گیاهی pbi121 تحت راه انداز camv 35s و خاتمه دهنده nos قرار گرفت و برای انتقال به ژنوتیپ های گزینش شده یونجه مورد استفاده قرار گرفت. برای این منظور پاسخ تراریختی دو جداکشت برگ و دمبرگ سه ژنوتیپ گزینش شده به سه سویه اگروباکتری lba4404، agl01 و gv3101 با زمان های مختلف هم کشتی و حضور استوسیرینگون در سوسپانسیون تلقیح مورد ارزیابی قرار گرفت. تعداد 21 جداکشت از جداکشت های مربوط به چهار و هشت روز هم کشتی، جنین های سوماتیکی مقاوم به کانامایسین تولید کردند که همه این جداکشت ها متعلق به ژنوتیپ های km-27 و kk-14 تلقیح شده با سویه های lba4404 و agl01 بودند. متوسط کارایی تراریختی دو جداکشت از دو ژنوتیپkm-27 و kk-14 با سویه های lba4404 و agl01 بر اساس تعداد گیاهان مقاوم به کانامایسین برابر 21/1 درصد بود. کارآیی تراریختی سویه های اگروباکتریوم مورد استفاده متفاوت و فراوانی تراریختی (درصد جداکشت های حاوی جنین های سوماتیکی مقاوم به کانامایسین) حاصل از سویه lba4404 بیشتر از دو سویه دیگر بود. تجزیه pcr با آغازگرهای اختصاصی ژن cry3a، حضور تراژن در 85% گیاهان مقاوم به کانامایسین را نشان داد. بررسی دورگ سازی سادرن در یکی از لاین های تراریخت نیز نشان داد که ژن cry3a در ژنوم این لاین در سه جایگاه مختلف تلفیق شده است. تجزیه لاین های تراریخت با استفاده از روش داس الایزا، بیان پروتئین cry3a در برگ گیاهان تراریخت را نشان داد. زیست سنجی گیاهان تراریخت با آفت سرخرطومی یونجه نشان داد که مقاومت لاین های تراریخت در برابر این آفت افزایش یافته است.