کلونینگ، ترادف، بیان و تعیین خصوصیات بیوشیمیایی آلفا آمیلاز حاصل از باسیلوس kra2
چکیده
در مطالعات قبلی، آنزیمی به نام kra2-آمیلاز مستقل از کلسیم، از سویهbacillus sp. kra2 جداسازی شد. توالی نوکلئوتیدی ژن آنزیم kra2-آمیلاز و توالی اسید آمینه ای آن نشان داد که این آنزیم، به صورت پیش ساز آنزیمی سنتز می شود که دارای یک پپتید راهنما (33 اسید آمینه) و یک پروپپتید 11 اسید آمینه ای بعد از آن در قسمت n-ترمینال، آلفا آمیلازی بالغ در قسمت مرکزی (422 اسید آمینه، kda48) و یک پروپیتید طویل در قسمت –c ترمینال (193 اسید آمینه،kda 21) می باشد. براساس نتایج کریستالوگرافی که در مطالعه دیگر انجام شد، معلوم شد که آنزیم آمیلاز بدست آمده از منشأ باکتری kra2، دو قطعه ابتدایی (44 اسید آمینه) و قطعه انتهایی (193 اسیدآمینه) ترادف اسید آمینه ای استنتاج شده از ترادف نوکلئوتیدی ژن کد کننده این آنزیم را ندارد. بنابراین فرض بر این شد که آنزیم فاقد هر دو ناحیه مذکور تحت عنوان آنزیم بالغ و آنزیم دارای ناحیه انتهای کربوکسیل و فاقد قطعه آمینو (44 اسیدآمینه ابتدایی)، آنزیم نابالغ نامیده شود. جهت تعیین نقش قطعه c-ترمینال در عملکرد آنزیم، هر دو ژن کد کننده آنزیم بالغ و نابالغ، به طور جداگانه در ناقل بیانی pet28-a (+) و باکتری اشریشیاکولی bl-21، کلون و بیان شدند. پروتئین های نوترکیب، توسط ستون نیکل آگارز ni-nta، خالص سازی و خصوصیات بیوشیمیایی آن ها از قبیل پارامترهای سینتیکی، اثر یون کلسیم بر روی پایداری حرارتی آنزیم، اثر دما بر پایداری آنزیم، تعیین محصول نهایی عمل آنزیم با استفاده از کروماتوگرافی لایه نازک (tlc)، اثر ph و نیز مطالعات ساختاری cd و فلورسانس، بررسی شد. نتایج، ph بهینه و محصولات نهایی هیدرولیز نشاسته یکسانی را برای هردوی آنزیم های بالغ و نابالغ نشان داد، در حالیکه پارامترهای سینتیکی آنزیم های kra2-آمیلاز با یکدیگر متفاوت بود. مقایسه پارامترهای سینتیکی نشان داد که آنزیم kra2-آمیلاز نابالغ، دارای km کمتر و یا تمایل بیشتر برای هر دو سوبسترای نشاسته و سوبسترای کروموژن (eps) است، در حالیکه بازده کاتالیتیکی هر دو شکل آنزیمی، مشابه است. بعلاوه، فعالیت آنزیم kra2به وسیله edta مهار نشد، که نشان دهنده عدم وابستگی آنزیم kra2-آمیلاز به یون کلسیم است. مطالعات ساختاری طیف سنجی دو رنگ نمایی دورانی در ناحیه دور uv، درصد صفحات β ی بیشتر، و نیز مطالعات پایداری حرارتی آنزیم های بالغ و نابالغ، tm بیشتر برای آنزیم نابالغ را نشان داد. همچنین نشر ذاتی آنزیم های بالغ و نابالغ، آب گریزی آن ها در حضور ans و نیز پایداری حرارتی آن ها با استفاده از فلورسانس اندازه گیری و با یکدیگر مقایسه شدند.