شناسایی، جداسازی و همسانه سازی ژن دلتا سیکس دسچوراز از گیاه گل گاو زبان ایرانی echium amoenum
چکیده
چکیده: امروزه با توجه به رشد تقاضا و اهمیت تغذیه ای که اسیدهای چرب دارند، بحث ارتقاء کیفیت دانه های روغنی از منظر سلامت، امنیت غذایی و نیز فرآوری صنعتی دارای اهمیت ویژه ای است. در سال های اخیر در کشورهای در حال توسعه و بویژه اروپا، پیشرفت های ارزنده ای در امر تغییر محتوای ژنتیکی دانه های روغنی در راستای تولید اسیدهای چرب صنعتی و تغذیه ای مهم بدست آمده است و گیاهان ترانس ژن گوناگونی با قابلیت های جدید معرفی گردیده اند. بدون شک دستکاری کارآمد محتوای چربی های گیاهی و محتویات آنها نیازمند دانستن جزییات دقیق بیوشیمیایی و مکانیسم های تنظیم بیوسنتز چربی هاست. در ده سال گذشته مطالعات بیوشیمیایی و ژنتیکی درک ما را از سنتز چربی ها و شناسایی آنزیم هایی که ترکیب روغن های ذخیره ای را تعیین می کنند افزایش داده اند به نحوی که امروزه با استفاده از تکنیک های بیولوژی مولکولی و ژنتیک بسیاری از ژنهای کد کننده این آنزیم ها، شناسایی، همسانه سازی و دستورزی گردیده اند. از بین اسیدهای چرب گامالینولنیک(gla) و استئارودونیک اسید(sda)، از لحاظ دارویی_ تغذیه ای و صنعتی بسیار ارزشمند بوده و در خانواده های گیاهی کمیاب هستند. glaو sda هر دو توسط فعالیت آنزیم دلتا 6 دسچوراز به ترتیب روی سوبستراهای اسید لینولئیک و آلفا لینولنیک سنتز می شوند. این آنزیم یک پیوند دوگانه را در موقعیت کربن 6 به این سوبستراها اضافه می کند و بدین طریق عمل غیر اشباع سازی (دسچوریشن) را انجام می دهد. عملی که آنزیم دلتا 6 دسچوراز انجام می دهد یک مسیر دسچوریشن اضافی است که تنها در تعداد محدودی از گیاهان عالی وجود دارد. در تحقیق حاضر cdna کد کننده آنزیم دلتا 6 دسچوراز، از گل گاو زبان ایرانی (echium amoenum) شناسایی، جداسازی و همسانه سازی گردید. برای این منظور با توجه به اطلاعات در دسترس در پایگاه ncbi، پرایمرهای مناسب جهت شناسایی ژن در سطح dna ژنومیک طراحی شد و در نخستین گام قطعه ای با طول bp 800 که همولوژی بسیار بالایی با ژن های گزارش شده قبلی داشت، از طریق واکنش زنجیره ای پلیمراز بدست آمد. سپس پرایمرهای ویژه جهت ایزولاسیون cdna ژن، که سایت های برشی آنزیم های sac i وxba i در ناحیه 5 پریم آنها تعبیه شده بود طراحی گردیدند. در گام بعدی total rna از اندام های مختلف گل گاو زبان (ریشه، ساقه، برگ، بذر، گل) استخراج شد. سپس با استفاده از rna استخراجی، و با استفاده از واکنش نسخه برداری معکوس اقدام به ساخت cdna کل گردید. cdna ساخته شده بعنوان الگو در واکنش زنجیره ای پلیمراز با استفاده از پرایم های ویژه ایزولاسیون استفاده شد، که منجر به تکثیر قطعهbp 1347 مربوط به cdna ژن دلتا 6 دسچوراز گردید. قطعه مذکور از روی ژل آگاروز خالص سازی گردید و در وکتور کلونینگ pbluscripts داخل باکتری اِ.کلای (dh5?) همسانه سازی شد. در نهایت پلاسمید نوترکیب حاوی اینزرت تعیین توالی گردید و پس از انجام آنالیزهای بیوانفورماتیکی مختلف، توالی کد کننده ژن دلتا 6دسچوراز گونه (e.amoenum) در پایگاه ncbi با شماره دسترسی مشخص به ثبت رسید