طراحی و ساخت وکتورهای ویروسی حامل ژن های زنجیره سبک و سنگین آنتی بادی مونوکلونال هرسپتین و بررسی بیان آن در سلول های یوکاریوتی
چکیده
چکیده: رسپتور her2 از خانواده تیزوزین کیناز ها می باشد که بیان بیش از حد آن در ایجاد سرطان های مختلف از جمله سرطان سینه ، پروستات ، کلون و تخمدان نقش مهمی دارد.هرسپتین اولین آنتی بادی مونوکلونال مورد تایید برای درمان سرطان سینه بدخیم +her2 است.به منظور تولید این آنتی بادی مونوکلونال ژن آن با استفاده از توالی پروتئینی آن در genebank سفارش وسنتز شد. برای اطمینان از تولید پروتئین با folding صحیح سلول های هدف با توجه به humanized بودن این آنتی بادی سلول های یوکاریوتی رده ی hek 293t انتخاب شدند. ژن زنجیره سبک و سنگین را در بدنه لنتی ویروسی به همراه توالی ires کلون کردیم. به منظور تولید ویروس نوترکیب، وکتور حامل به همراه وکتور های packaging و envelope با روش کلسیم - فسفات ترانسفکت شدند و پس از 48 ساعت محیط کشت این سلول ها تغلیظ و پس از تست تولید هر دو زنجیره باتکنیک rt-pcr سلول های hek 293t را با لنتی ویروس های تغلیظ شده infect کردیم.پس از 72 ساعت تولید هر دوزنجیره دوباره با rt-pcr تست شد.از آنجایی که هرسپتین ترشحی است ، پروتئین های محیط کشت سلول های infect شده را با tca رسوب داده وبیان را با تکنیک sds-page سنجیدیم .با توجه به نتیجه مثبت ، تاخوردگی و اتصال آن را به گیرنده her2 در سطح رده های سلولیmcf-7 وskbr3 با تکنیک ایمونوسیتوشیمی بررسی و نور فلورسنت را در هر دو رده مشاهده نمودیم. mtt assayنیز عملکرد صحیح این پروتئین را در جهت توقف رشد رده ی mcf-7و مرگ سلولی رده ی skbr3 نشان داد.