بررسی بیان ژنهای خود بازسازی ns ، oct4 و nanog در سرطان معده و اثر مهار آنها بر روند تکثیر رده سلولی سرطان معده
چکیده
سال هاست که دو مدل متضاد برای منشا سرطان مطرح شده است. در یک فرضیه چنین استنباط می شود که سلولهای بنیادی بالغ برای شروع فرایند توموزایی ضروری می باشند در حالیکه در فرضیه دیگر چنین ادعا می شود که سلولهای تمایز یافته تمایز خود را از دست داده، باز برنامه نویسی و تبدیل به سلولهای سرطانی می شوند. هدف اصلی در این مطالعه، بررسی فرضیه های مذکور در سرطان معده بود. به همین منظور بیان تعدادی از ژن های دخیل در خودبازسازی سلولهای بنیادی و علاوه بر آن ژنهای باز برنامه نویسی در سرطان ادنوکارسینومای معده مورد بررسی قرار گرفت و در نهایت با تو جه به الگوی بیانی ژنهای مذکور در تومورهای معده، بیان رونوشتهای ns و oct4b1 در رده های سلولی سرطانی معده با استفاده از استراتژی rnai سرکوب و اثرات فنوتیپی و مولکولی مهار آنها مورد بررسی قرار گرفت. در بخش اول این تحقیق بیان بالقوه ژنهای خودبازسازی و باز برنامه نویسی در تومورها، بافتهای غیر توموری، رده سلولی سرطانی معده، ags، با استفاده از روش real-time rt-pcr مورد مطالعه قرار گرفت. نتایج نشان دادند که بیان واریانتهای ژن oct4 در نمونه های سرطانی نسبت به نمونه های غیر توموری معده افزایش می یابد. نتایج مشابه ای در بررسی بیان ژن نوکلئوستمین مشاهده شد. در بررسی بیان ژنهای sox2 و klf4 نتایج متفاوتی به دست آمد به طوری که در بررسی بیان ژنهای nanog و lin28 عدم بیان این ژنها در نمونه های توموری و غیر توموری مشاهده گردید. در بخش دوم تحقیق، برای بررسی نقش ژنهایی که در سرطان افزایش بیان داشتند بیان آنها با استراتژی rnai مهار گردید. بیان ژنnucleostemin در رده سلولی سرطانی معده، ags، در سطح mrna و پروتئین مورد بررسی قرار گرفت، بررسی جایگاه درون سلولی این پروتئین، با استفاده از روش ایمنوسیتوشیمی فلورسنس، در سلول های ags نشان داد که در این سلولها نیز این پروتئین جایگاه درون سلولی هستکی دارد. در بخش بعدی ، بیان ژن nucleostemin با استفاده از روش rnai مهار شد. نتایج نشان داد که مهار nucleostemin بر روی مورفولوژی سلولهای ags تاثیرات بارزی می گذارد و مورفولوژی این سلولها به فرم شبه مرغ ماهیخوار تغییر می یابد. بنظر می رسد عملکرد nucleostemin غیر وابسته به پروتئین p53 و از نظر کنترل توزیع سلول ها در فازهای مختلف چرخه سلولی به حضور پروتئین های عملکردی klf4 و p21 در این رده سلولی بستگی داشته باشد. آزمایش پیری سلولی نشان داد که nucleostemin به عنوان یک فاکتور ضد پیری در سلولهای ags عمل می کند. در بخش آخر تحقیق، بیان و عملکرد واریانت تازه کشف شده oct4 بنام oct4b1 در سرطان معده مورد مطالعه دقیق قرار گرفت و بیان این واریانت با تکنیک rnai مهار شد. پس از مهار این واریانت سلولها تغییرات مورفولوژی خاصی شبیه به سلولهای غول پیکر چند هسته ای را نشان دادند. در بررسی توزیع چرخه سلولی پس از مهار oct4b1 دو فاز سلولی مشاهده گردید یک فاز مربوط به سلولهایی که دچار آپپتوز شده بودند که برای تایید این دسته از سلولها از کیت annexin-v و سنجش فعالیت caspase3,7 استفاده شد که نتایج حاصل از فلوسیتومتری را تایید می کردند. دسته دیگر سلولهای غول پیکر چند هسته ای که دارای واکوئل های متعددی بودند و با رنگ امیزی گیمسا وجود آنها تایید شد. چنین گفته می شود که این سلولها در برابر القای آپپتوز مقاومند و این حالت را نوعی مقاومت در برابر القای آپپتوز می دانند. پس از این بررسی برای اولین بار مشخص شد که به احتمال فراوان oct4b1 به عنوان یک فاکتور آنتی آپپتوزیس در این سلولها عمل می کند. در کل این یافته ها علاوه بر مشخص نمودن بخشی از مکانیسم های مولکولی درگیر در سرطان معده، می تواند منجر به گسترش دانش کنونی در زمینه تومور مارکرها و درمان سرطان معده گردد.