بررسی عملکرد ژن های atpap9 و atpap18 رمزکننده اسید فسفاتازهای ارغوانی از گیاه آرابیدوپسیس تالیانا
چکیده
اسید فسفاتازهای ارغوانی(pap) (ec 3.1.3.2) آنزیم های متالوفسفواسترازی هستند که هیدرولیز پیوندهای استری فسفات را در گستره وسیعی از سوبستراها برعهده دارند. در ژنوم آرابیدوپسیس 29 جایگاه ژنی رمز کننده اسید فسفاتازهای ارغوانی شناسایی شده است. به لحاظ ساختاری pap های گیاهی به دو گروه، با وزن مولکولی بالا و پایین تقسیم می شوند. گروه اول به شکل همودایمر فعالند در حالی که گروه دوم که تنها دارای دامین متالوفسفاتاز هستند به شکل منومر فعالیت می کنند. در مقایسه با اسید فسفاتازهای ارغوانی با وزن مولکولی پایین اهمیت زیستی انتهای آمینی و دامین فیبرونکتین و همچنین ساختار دایمری موجود در اسید فسفاتازهای ارغوانی با وزن مولکولی بالا ناشناخته باقی مانده است. در این پژوهش عملکرد ژن های atpap18 و atpap9 با استفاده از روش های مختلف بررسی شده است. این دو ژن به ترتیب hmwو lmw بوده و بیان هر دو در شرایط فقدان فسفات القا شده و هر دو وارد مسیر ترشحی می شوند. بیان فراوان ژن atpap18 منجر به افزایش فعالیت اسید فسفاتازی، ذخایر فسفات و تولید مواد زیستی در گیاهان ترایخت توتون و آرابیدوپسیس گردید. بررسی استقرار سلولی پروتئین atpap18 با استفاده از بیان گذرای این ژن با سازه 35s::atpap18-gfp در سلول های بشره پیاز نشان دهنده استقرار آن در واکوئل و همچنین ترشح آن به خارج از سلول است. آزمایش مشابهی با تراریختی پایدار گیاهان آرابیدوپسیس و سازه 35s::atpap18-gus در محیط واجد فسفات انجام شد. نتایج نشان دهنده حضور رنگ آبی در سلول های تار کشنده و تریکوم و ترشح آن به مقدار زیاد به خارج از این سلول ها بود. در گیاهان آرابیدوپسیس تراریخت شده با سازه 35s::sp18-gus رنگ آبی در محیط واجد فسفات در ریشه ها و در محیط فاقد فسفات در اندام هوایی مشاهده شد. بیان پایدار ژن gfp با استفاده از سازه های 35s::atpap18-gfp و 35s::sp18-gfp در گیاهان آرابیدوپسیس نتایجی مشابه با سازه های دارای ژن gus را ایجاد نمود. همچنین در این پژوهش، وجود دو نسخه متفاوت رونویسی که توسط ژن atpap9 رمز می شود با بررسی لاین های t-dna تایید شد. الگوی بیان هر دو نسخه به طور جداگانه ارزیابی شد. تفاوت نسخه atpap9-2 با نسخه atpap9-1 فقط در انتهای 5 آن است که اهمیت آن مورد بررسی قرار گرفت. الگوی بیان atpap9-1 با اتصال پروموتر آن به ژن گزارشگر gus بررسی شد و نتایج نشان داد که این ژن ویژگی بیان بافتی دارد. نسخه atpap9-1 بیان بالایی در گوشوارک ها و بافت آوندی، به ویژه در پاسخ به آلودگی قارچی دارد. محل استقرار پروتئین atpap9-1 با اتصال آن به ژن gfp مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که این پروتئین در اتصال غشای پلاسمایی به دیواره سلولی درگیر است. این یافته ها همراه با طرح های ساختاری پروتئین atpap9-1 نشان می دهند که این پروتئین احتمالا یکی از اجزای مسیر پیام رسانی است.