مطالعه موتاسیون های موجود دراگزون شماره یک از ژن p53 درلنفوسارکوم گاو به روش واکنش زنجیره ای پلی مراز و تعیین توالی آن
چکیده
بیماری لکوز انزوتیک گاو یک بیماری ویروسی در گاوهای بالغ است که مشخصه آن دگرگونی نئوپلاستیک لنفوسیت ها در بافت های لنفی بویژه عقده های لنفاوی است. شیوع عفونت در گله های گاوان بخصوص گاوهای شیری بالا است اما فقط تعداد کمی از این گاوان نشانه های ابتلاء به لنفوسارکوم را نشان می دهند. موتاسیون در ژن p53 نقش مهمی در پاتوژنز لکوز انزوتیک گاوان بازی می کند. مطالعات قبلی حاکی از آن است درگاو های آلوده به این ویروس، که نشانه های ابتلاء به تومور را نشان می دادند و تکثیر غیرعادی لنفوسیت های b را داشتند، ژن p53 جهش یافته بود اما در خون محیطی گاوهای سالم و نیز گاوهای حامل یا به ظاهر سالم، جهش در این ژن یافت نشد. در این پایان نامه برآن شدیم موتاسیون های رخ داده در اگزون شماره یک از ژن p53 را در گاوهای مبتلا به لکوز انزوتیک به روش زنجیره پلی مراز(pcr) مطالعه کرده و توالی آن را تعیین کنیم. بمنظور اجرای این پروژه تعداد 26 نمونه بلوک پارافینه مربوط به لنفوسارکوم گاو از آرشیو بخش پاتولوژی دانشکده دامپزشکی تبریز، مورد استفاده قرار گرفت. لام های تهیه شده از بلوک های پارافینه، به وسیله میکروسکوپ نوری مدل olympus-ch30 (ساخت ژاپن)، به منظور تایید وجود تومور، تشخیص نوع آن، تعیین اندازه لنفوسیت های توموری شده و تعیین درجه بدخیمی آن مورد مشاهده قرار گرفتند و تصاویر مربوط به لام ها، بوسیله دوربین olympus dp12,u-tvo.5xc-2(japan) تهیه شد. سپس استخراج dna این نمونه ها به 2 روش جوشاندن و استفاده از کیت ژل سیلیکا انجام شد و پس از ارزیابی غلظت dna موجود به وسیله الکتروفورز، تکثیر بخشی از ژن p53 با pcr انجام گرفت. محصول این واکنش با وزن حدود 500 جفت باز به روش 2طرفه سنجر تعیین توالی شد. نتایج سکانس کردن با استفاده از نرم افزارهای blast مورد جستجوی همانندی نوکلئوتیدی قرار گرفت. در بین نمونه های مورد مطالعه، ابتلاء 8 مورد از گاوان به لکوز آنزئوتیک از نظر هیستوپاتولوژیکی مورد تائید قرار گرفت. در بین لنفوسارکوم های تشخیص داده شده، ازنظر انتشار لنفوسیت های توموری، 7 مورد دارای الگوی انتشار diffuse، 1 مورد فولیکولار، ازنظر اندازه لنفوسیت ها، 4 مورد دارای لنفوسیت های بزرگ، 1 مورد لنفوسیت های کوچک، 3 مورد مخلوط لنفوسیت های بزرگ و کوچک، ازنظر هسته، 4 مورد دارای هسته شکافته و 4 مورد دارای هسته غیرشکافته و میانگین اندیس میتوز 125/2 بود. از 8 مورد ذکر شده، یک مورد دارای بدخیمی پائین و هفت مورد دارای بدخیمی متوسط بودند و درنهایت نوع لنفوسارکوم ها از نظر تشخیص نهایی یک مورد diffuse large noncleaved lymphosarcoma، سه مورد diffuse large cleaved، سه مورد diffuse mixed و یک مورد follicular small cleaved بود. نتایج مطالعه مولکولی حاکی از شباهت بسیار زیاد توالی های بدست آمده با بخشی از ژن p53 ثبت شده در بانک جهانی ژن بود. توالی های بدست آمده به تصویر in silico مورد ترجمه قرار گرفت و نتایج همانندی توالی اسیدهای آمینه، توسط نرم افزارهای موجود در سایت expasy مورد مقایسه قرار گرفت. در نمونه های کار شده هیچ جهشی در اگزون شماره یک از ژن p53 مشاهده نشد.