غربال گری باکتریایی به منظور جداسازی ژن گلیفوسیت اکسیدورداکتاز (gox) و انتقال به گیاه کلزا برای افزایش تحمل نسبت به گلیفوسیت
چکیده
متحمل سازی گیاهان زراعی نسبت به علف کش گلیفوسیت از طریق دست ورزی های ژنتیکی یکی از کاراترین روش های موجود در کنترل علف های هرز مزارع محسوب می شود. گلیفوسیت با مهار آنزیم epsps (5-انول پیرویل شیکیمات-3-فسفات سنتاز) در مسیر شیکیمات مانع سنتز اسید های آمینه حلقوی و در نتیجه مرگ گیاه می شود. برای توسعه گیاه با سطح تحمل قابل قبول در مقیاس تجاری، علاوه بر دست ورزی آنزیم epsps، به کار گیری ژن-های مربوط به آنزیم های تجزیه کننده گلیفوسیت نظیر gox (گلیفوسیت اکسیدورداکتاز) نیز ضروری می باشد. این آنزیم علف کش را به ترکیب آمینومتیل فسفونیک اسید (ampa) و گلی اکسالات که اثر کشندگی کمتری برای گیاه دارند تبدیل می کند. این ژن برای اولین بار از باکتری خاک زیochrobactrum antrophi سویه lbaa جدا شده است. در تحقیق حاضر، از خاک های باغات مناطق مختلف ایران با سابقه استفاده از علف کش گلیفوسیت نمونه برداری شده است و با روش های غنی سازی، باکتری هایی که قادر به رشد در محیط حاوی 3 میلی مولار گلیفوسیت به عنوان تنها منبع فسفات بودند، غربال شدند. مسیر تجزیه در باکتری مربوط به جنسochrobactrum با روش hplc مورد بررسی قرار گرفت و ترکیبampa به عنوان ماده حدواسط شناسایی شد. این باکتری می تواند کاندید مناسبی برای تجزیه زیستی گلیفوسیت نیز باشد. لذا، براساس توالی ژن gox ثبت شده در پایگاه اطلاعاتی ncbi، آغازگرهای اختصاصی طراحی گردید و تلاش شد تا با انجام واکنش زنجیره ای پلیمراز این ژن از باکتری های مذکور جداسازی گردد. با توجه به اینکه محصول تکثیر یافته پس از هم ردیفی با توالی ژن gox همسانی نداشت، لذا، ژن آن به طور مصنوعی ساخته شد. در این راستا، با کمک نرم افزارهای مختلف رایانه ای برای افزایش کارایی بیان ژن در گیاه، رمزهای ژن gox متناسب با گیاه brassica napus l. بهینه سازی گردید. همچنین درصد gc آن کاهش داده شد، عناصر تنظیمی منفی کاهش و توالی های مفید شامل کوزاک برای افزایش دقت ترجمه در آن تعبیه شد. ژن مصنوعی در ناقل بیانی گیاه (pbi121) همسانه سازی شد و برای تراریختی گیاهان کلزا در جهت ارزیابی اثر آن در مقاومت به گلیفوسیت به کار گرفته شد. پس از باززایی گیاهچه های تراریخت شده، نمونه ها در آزمایشگاه با روش کمی رقابتی زنجیره ای پلیمراز(qc-pcr) مورد بررسی قرار گرفتند و تعداد نسخه تراژن در 9 لاین مختلف تراریخت سنجیده شد. مقایسه نتایج بدست آمده با روش دورگه سازی سادرن در حدود 89 درصد شباهت را نشان داد و داده ها تنها برای یک لاین متفاوت بود. همچنین با روش کمی رقابتی rt-pcr، میزان بیان mrna در نه لاین مذکور اندازه گیری شد. نتایج بدست آمده نشان داد که لاین های 4، 7، 9 و 12بیشترین بیان را نشان دادند. در عین حال، بررسی فنوتیپی گیاهان t1 با پاشش گلیفوسیت بر روی گیاهان تراریخت و گیاه تیپ وحشی به عنوان شاهد، انجام شد. نتایج حاصل نشان دادند که گیاهان تراریخت، علف کش گلیفوسیت را تا سطح 5/1 میلی مولار تحمل می-نمایند. گرچه این میزان در حد محصولات تراریخت تجاری شده نیست، ولی بکارگیری این ژن در کنار ژن epsps مقاوم (با جهش های دوگانه) امکان ایجاد مقاومت در حد بالاتری را برای اهداف تجاری سازی کلزای تراریخت فراهم خواهد کرد.
اساتید راهنما و مشاور
علی هاتف سلمانیان، امیر موسوی، کامبیز اکبری نوقابی، خسرو خواجه