بررسی تاثیر شرایط محیط کشت و بهینه سازی تولید آنزیمهای آمیلاز و پلولاناز توسط اگزیگوآباکتریوم sp. sh3
چکیده
در سال 2008 محققین تونسی اثر signal peptides مختلف را در بیان و ترشح آنزیم پلولاناز کلون شده ازgeobacillus thermoleovarnse در e.coli ارزیابی کردند و موفق به ترشح آنزیم کلون شده توسط سیگنال پپتید آلفا آمیلاز باکتری bacillus stearothermophilus شدند (4) t.kuriki و همکارانش در سال 1990 موفق به کلون کردن و تعیین توالی آنزیم پلولاناز باکتری bacillus stearothermophilus شدند که آنزیم ترموفیل تولید شده دردمای 75 درجه سانتیگراد حداکثر فعالیت را دارا است(6). مقاوم ترین آنزیم نسبت به حرارت که تا سال 2006 شناخته شده متعلق به باکتری باسیلوس an-7است که بهینه فعالیت آن در دما 90درجه سانتیگراد بوده و در80 درجه سانتیگراد نیمه عمری معادل بیش ازیک روز دارد.( 1) آنزیم مورد بررسی محققین آلمانی یک آنزیم دو زیر واحدی است که در دمای 80 درجه سانتیگراد حداکثر فعالیت را دارد. این آنزیم تیپ ii از نظر سوبسترا نسبت به سایر آنزیم های آرکیال وسیع الطیف تر بوده و به سیکلودکسترین نیز اثر می کند.( 6) بیشترین تحقیقات در مورد آنزیم پلولاناز در باکتری k. aerogenes صورت گرفته اما t. brockii پلولانازی تولید می کند که به حرارت مقاوم بوده وph ایده آل آن 5 است.(16) آنزیم پلولاناز klebsiella aerogenes کلون شده در e.coli به صورت درون سلولی ساخته می شود اما ساب کلون کردن آن به درون k.aerogenes بیان خارج سلولی را، 20 تا 40 برابر افزایش می دهد.(24) از باکتری باسیلوس گونه xal601 ژنی به نام aapt جدا شده که محصول آن یعنی آنزیم aapt ، هر دو عمل آمیلازی و پلولانازی را نشان می دهد.(13). از باکتری باسیلوس گونه ksm1378 نیز آمیلوپلولانازی جدا شده که هر دو فعالیت آمیلازی و پلولانازی را دارد اما بر خلاف آنزیم مشابه در c.thermohydrosulfuricum جایگاه فعال هر دو عمل یکسان نیست. از طریق داده های کینتیکی مشخص شده که دو جایگاه مختلف این اعمال را به عهده دارند و می توان به وسیله پاپائین دو آنزیم را از یکدیگر جدا کرد.(8) آنزیم aapt کلون شده در e.coli زمانی که در باسیلوس ساب کلون شود، دو فرم کوتاه شده ایجاد می کند که مقاومت آنها به شرایط قلیایی با آنزیم اصلی متفاوت است و طیف ph از قلیایی به خنثی سوق پیدا می کند. چون این کوتاه شدن از انتهای کربوکسیل صورت گرفته، پس این ناحیه در مقاومت به شرایط قلیایی موثر است. (13) به منظور صنعتی کردن تولید آنزیم ما نیازمند بهبود عملکردسیستم ها و بدست اوردن بیشترین بازده بدون افزایش قیمت تمام شده تولید آنزیم در کوتاه ترین زمان ممکن باشیم. افزایش و تولید آنزیم های میکروارگانیسم ها به شدت تحت تاثیر ترکیبات محیط کشت می باشدو به این منظوربهینه کردن ترکیبات ترکیبات محیط کشت رشد باکتری و پارامترهای موثر بروی کشت جز مهمی از فرآیند بیولوژیست. به منظور بهینه کردن نیازمند بررسی برهمکنش های در بین عوامل موثر در فرآیند هستیم.محدودیت هایی که در بهینه کردن تک تک فاکتورها بدون بررسی برهمکنش های بین این عوامل رامی توان به کمک استفاده از تکنیک (rsm)response surface methodology که به بررسی و توضیح و ترکیب فاکتورهای تاثیرگذار در قرآیندهای تولید آنزیم می پردازد.rsm منجر به خلاصه شدن استراتژی های بررسی آزمایشات می شود.متد های آماری به صورت گسترده برای بهینه کردن تولید آنزیم های خانواده آمیلارها می شود. در مرحله اول بهینه کردن از طراحی placket-burman به منظور مشخص کردن عوالم موثر بر روی تولید آنزیم بررسی می شود و در مرحله بعد فاکتورهای موثر موسط روش central composite design بهینه می شود.