بررسی اثر کاهش بیان grp78 درسلول های اپی تلیالی رنگدانه ای شبکیه ی انسانی (rpe) و تاثیر آن بر روی بیان فاکتورهای رگزایی
چکیده
مقدمه شبکه آندوپلاسمی به واسطه وجود چاپرون هایی نظیر grp78 نقش مهمی در بلوغ و تاخوردگی پروتئینها بازی میکند. تجمع پروتئین های تا نخورده در شبکه آندوپلاسمی منجر به فرایند استرس شبکه آندوپلاسمی می شود که پاسخ به این فرایند با کاهش کلی سنتز پروتئین و افزایش بیان چاپرون هایی نظیر grp78 همراه می باشد. در سلولهای رنگدانه دار شبکیه چشم افراد بالغ طولانی شدن فرایند er stress باعث مرگ برنامه ریزی شده این سلولها شده و به احتمال زیاد منجر به تغییراتی در شبکیه مانند نو- رگزایی می گردد که این امر منتج به آسیب های شبکیه و بیماری های شبکیه نظیر amdوrp میشود. هدف از این مطالعه بررسی کاهش بیان grp78 در سلولهای rpe و اثر آن برروی برخی از فاکتورهای مهم رگزایی ونیز اثر آن برروی آپوپتوز و تکثیر سلولی بود. در این پژوهش سلولهای rpe از کره ی چشم انسان بالغ که از بانک چشم جمهوری اسلامی ایران تهیه شده بود ، جداسازی شد ودر محیط کشت dmem/f12 که حاوی %?? سرم جنین گوساله (fbs ) در کشت اولیه و%?? سرم جنین گوساله در پاساژهای بعدی بود کشت داده شد. هویت سلولها به وسیله ی مارکرهای اختصاصی rpe65 و سیتوکراتین 18/8 اثبات شد. سلولها بین پاساژهای 2-7 توسط sirna مخصوص knock down در سطح رونویسی علیه grp78 مورد تیمار قرار گرفتند. سلولهای تیمار شده با sc sirna ، transfection reagent و سلولهای rpe بدون تیمار به عنوان کنترل های آزمایش مورد بررسی قرار گرفتند. پس از استخراج rna از سلول ها وبررسی با real time-pcr انجام knock down برروی grp78 مورد تایید قرار گرفت. متعاقب آن rna از سلول های rpe که به شیوه قبل knock down شده بودند ونیز سلول های کنترل که در بالا به آنها اشاره شد، استخراج شد و توسط تکنیکreal time-pcr ، در سطح رونویسی، تغییرات میزان بیان ژنهایvegfa ، vegfr-2 ، mmp-2، mmp-9،ctgf ،timp-1 ، timp-2، cathepsin d، ?-sma مورد بررسی قرار گرفت. همچنین تکثیر،زنده ماندن ومرگ سلولهایrpe تیمار شده با استفاده از تکنیک elisa بررسی شد. نتایج real time pcr کاهش قابل ملاحظه ای دربیانgrp78 نشان داد. بیان ژنهای timp-2 vegf-a ، (kdr or flk-1)vegfr-2 و mmp-2 کاهش معنی داری را نشان داد. مقدار رونوشت هایctgf,mmp-9، timp-1 ، cathepsin dو ?-sma بدون تغییر باقی مانده بود. تیمارهای rnai هیچ اثر ناخواسته ای برروی مرگ برنامه ریزی شده و تکثیر سلولی در سلولهای ترانسفکت شده در مقایسه با کنترل ها نداشت.