شناسایی، جداسازی و تعیین خصوصیت برخی ژنهای افتراقی در واکنش تحمل به شوری در گیاه نعناع فلفلی با استفاده از تکنیک cdna-aflp
چکیده
شوری یکی از مهمترین عوامل محدود کننده در بیش از 35 درصد زمینهای زراعی است. شناسایی سازوکارهای مولکولی که در پاسخ گیاهان به شوری دخیل است، میتواند به بهبود منابع ژنتیکی در اصلاح گیاهان کمک نماید. نعناع فلفلی یک گیاه دارویی و معطر است که میزان روغنهای ضروری موجود در آن تحت تاثیر عوامل محیطی مختلفی مثل خشکی، شوری و نوع خاک قرار می گیرد. تکنیک cdna-aflp برای شناسایی برخی از ژنهای افتراقی پاسخ دهنده به تنش شوری در گیاه نعناع فلفلی به کار گرفته شد. این آزمایش در قالب طرح کاملا تصادفی با سه تکرار و سطوح شوری صفر، 50، 100 و 150 میلی مول در لیتر nacl انجام پذیرفت. 4 ماه پس از کشت، گیاهان برداشت شده و rna بافت گیاه با استفاده از کیت rneasy qiagen استخراج شد. رشته اول cdna با استفاده از آنزیم رونوشت بردار معکوس بر اساس mrna تخلیص شده، ساخته شده و رشته دوم از روی رشته اول با استفاده از آنزیم dna پلیمراز ساخته شد. cdna دو رشته ای با استفاده از آنزیم های برشی psti و taqi هضم شد. تکثیر اولیه قطعات cdna برش یافته صورت پذیرفت و تکثیر ثانویه با استفاده از آغازگرهای انتخابی با دو نوکلئوتید اضافی انجام شد. محصولات pcr بر روی ژل پلی آکریل آمید 5% جداسازی شد و تعداد 63 قطعه دارای بیان افتراقی از ژل بریده شده و dna موجود در ژل پس از استخراج تحت همان شرایط تکثیر ثانویه مجدداً تکثیر شدند. 21 قطعه تکثیر شده در باکتری e.coli و با استفاده از کیت کلون جت همسانه سازی شده و سپس توالی یابی شدند. توالی های حاصل با استفاده از blast x مورد ارزیابی و تحلیل قرار گرفت. 19 قطعه توالی یابی شده با توالی ژنهای شناخته شده در سایر گونه های گیاهی شباهت داشته است که در چندین گروه ژنی شامل انتقال سیگنال مثل فسفولیپازc، سم زدایی رادیکالهای آزاد همچون آهن سوپراکسیددسموتاز، تنظیم ساختار یا تخریب پروتئین مثل بکلین و چاپرونین 60، متابولیسم چون کاردیولیپین سنتاز، حمل و نقل مثل abc-t و پروتئین های دفاعی و مرتبط با تنش در گیاه همچون آدنوزین?5-فسفوسولفات رداکتاز ، طبقه بندی شده اند.12 توالی در بانک جهانی ژن (ncbi) ثبت گشته و شماره های دسترسی به آنها تعلق گرفت.