کلونینگ ژن ip3r انسانی، طراحی و ساخت سنسور جهت سنجش ip3با استفاده از لوسیفراز قطعه ای
چکیده
اینوزیتول تری فسفات ip3)) یک پیام بر ثانویه است که با هیدرولیز فسفاتیدیل اینوزیتول 4،5- بیس فسفات توسط فسفولیپاز-c تولید می شود. ip3 نقش مهمی در آزاد سازی کلسیم از ذخایر سلولی دارد. خروج کلسیم داخل سلولی از طریق اتصال ip3به پروتئین گیرنده غشایی ip3 و باز شدن کانال های روی غشا انجام می شود. اختلال در این مسیر، منجر به اختلالات متابولیسمی و به دنبال آن بسیاری از بیماری های متابولیکی می شود. اهمیت متابولیکی این مولکول، ساخت یک سنسور زیستی را جهت شناسایی آن مورد توجه قرار می دهد. یکی از روش های جدید بررسی عملکرد پروتئین ها و ترکیبات درون سلول، استراتژی مکمل سازی قطعات پروتئین های گزارشگر(protein-fragment complementation strategy) است. برای سنجش مولکول های زیستی کوچک، با تعبیه کردن دمین های حامل جایگاه اتصال مولکول مورد نظر درون ساختار پروتئین های گزارشگر، سنسورهای زیستی ایجاد می شود. این سنسورهای زیستی قابلیت ردیابی ترکیبات سلول را داشته و با میانکنش مولکول هدف با جایگاه اتصال خود، سنسور نشر نور خواهد داشت. سنسور طراحی شده در این رساله متشکل از دمین هسته اتصال به ip3 بوده که در بین قطعات جدا شده لوسیفراز قرار گرفته است. اتصال ip3 به جایگاه خود منجر به تغییرات کانفورماسیونی شده و باعث بازآرایی پروتئین گزارشگر لوسیفراز و متعاقب آن نشر نور می شود. سازه ساخته شده به داخل سلول hek293t انتقال یافته و در حضور ip3 میزان فعالیت آن بررسی شد. نتایج نشان داد که اتصال لیگاند منجر به نشر لومینسانس می شود. اگرچه سنسور ساخته شده دارای فعالیت پایه است اما نسبت سیگنال در حضور ip3 به طور قابل توجهی از فعالیت پایه آن در عدم حضور ip3 بالاتر است. سیگنال در سیستم in vitro حدود 11 برابر و در حضور القاکننده های رهایش ip3 در سلول زنده (living cell) حدود 8 برابر قوی تر از فعالیت پایه است.