بهینه سازی کشت بافت و بررسی انتقال ژن به گیاه بنفشه افریقایی.
چکیده
بنفشه آفریقایی یکی از مهم ترین گیاهان زینتی در سراسر جهان به شمار می رود. این گیاه غالبا مورد تهاجم بوسیله قارچ های fusarium oxxyporum، گونه های مختلف phytophtora ، pythium و botrytis قرار می گیرد که باعث ایجاد بیماری پوسیدگی ریشه و طوقه، سفیدک پودری و بلایت باکتریایی می شوند. برای افزایش بازارپسندی در این گیاه و ایجاد ارقام جدید نیاز به تکنیک های مهندسی ژنتیک می باشد که چشم انداز-های نو برای توسعه صنعت باغبانی از طریق ایجاد صفات برتر و مفید فراهم می کند. سیستم سریع باززایی از طریق in vitro یکی از مسایل اساسی برای تکثیر سریع و دستکاری های ژنتیکی از بنفشه آفریقایی می باشد. در این پژوهش برای توسعه باززایی سریع با کارایی بالا و سیستم سازگاری برای بنفشه آفریقایی از قطعات دمبرگ در محیط پایه rm با ترکیبات مختلف هورمونی استفاده شد. توسعه و بهینه کردن پروتوکل مناسب باززایی در شرایط درون شیشه ای در کم ترین زمان برای بنفشه آفریقایی انجام شد. باززایی از هر دو طریق اندام زایی و جنین زایی سوماتیکی با فراوانی بالا انجام شد. همچنین توسعه تشکیل سریع ریشه و پروتوکل مناسب جهت سازگاری گیاهچه های باززا شده از کشت درون شیشه ای انجام شد. پروتوکل بدست آمده یک سیستم کشت بافت سریع، ساده، قابل اطمینان برای تکثیر تجاری و برای تراریزش بنفشه آفریقایی می تواند محیا کند. انتقال ژن به روش ریز پرتابی یک سیستم رایج برای انتقال ژن است و از طریق تفنگ ژنی صورت می گیرد. از اینرو بهینه سازی پارامتر های موجود در این روش می تواند منجر به افزایش احتمال انتقال پایدار ژن های مفید از قبیل ژنهای مربوط به تغییر رنگ و شکل گل و مقاومت به آفات و بیماری ها به گیاه بنفشه آفریقایی شود. در این تحقیق انتقال و بیان موقت ژن گزارشگر gus در نمونه های برگی استریل گیاه بنفشه آفریقایی با روش ریزپرتابی مورد بررسی قرار گرفت. با بررسی بیان موقت ژن gus از طریق رنگ آمیزی هیستوشیمیایی، استفاده از ذرات طلا با تنظیم فاصله آداپتور از بافت برگی روی 5 سانتی متر در فشار psi 1350 برای انتقال ژن پایدار به این گیاه مناسب تشخیص داده شد. در این پژوهش ژن کیتیناز که باعث القای مقاومت به بیماری می شود از طریق ریز پرتابی به گیاه بنفشه آفریقایی انتقال داده شد. بمباران قطعات برگی با پلاسمید pbin61 که دارای کاست ژن کیتیناز (ech42) و ژن گزینشگر نئومایسین فسفو ترانسفراز (nptii) انجام شد. باززایی روی محیط حاوی کانایسین 50 میلی گرم در لیتر بدست آمد. جهت افزایش فشار گزینش گیاهان باززا شده به محیط حاوی 100 میلی گرم در لیتر کانامایسین منتقل شد. آنالیز pcr از dna استخراج شده گیاهان مثبت به ech42 حضور ژن ech42 را در گیاهان تایید کرد. آنالیز rt-pcr نیز بیان ژن ech42 را در 3 گیاه تراریخت تایید کرد. نتایج حاصل برای اولین بار در بنفشه آفریقایی کارایی تراریزش از قطعات برگ را نشان می دهد