بررسی اثر تغییر در اسید آمینه جایگاه 300 آنزیم لوسیفراز و بررسی خصوصیات آنزیم با جهش زایی هدف دار
چکیده
چکیده: پدیده بیولومینسانس تبدیل انرژی شیمیایی به نور توسط موجودات زنده را گویند که واکنشی آنزیمی می باشد که به واسطه دخالت آنزیم لوسیفراز و سوبسترای لوسیفرین انجام می گیرد. لوسیفرازآنزیمی پراکسیزومی می باشد که طی دو مرحله، مرحله ی لیگازی با استفاده از atp و mg2+ و مرحله ی مونواکسیژنازی و با استفاده از o2 باعث تبدیل سوبسترای خود (لوسیفرین) به ترکیب برانگیخته ی اکسی لوسیفرین می شود که در هنگام برگشت به حالت پایه ایجاد نور با بازده کوانتومی بالا می کند. آنزیم لوسیفراز دارای کاربردهای فراوان صنعتی و تشخیصی می باشد ولی عواملی همچون پایداری پایین لوسیفراز نسبت به حرارت و km بالا برای سوبسترای atp استفاده از آن را محدود کرده است. از این روی درسالهای اخیر با توسعه فناوری و با بکارگیری جهش زایی های هدفمند سعی در تهیه نمونه جهش یافته مناسب برای بهره گیری بیشتر از این آنزیم صورت گرفته است. مطالعات مهندسی پروتئین برای این آنزیم حاکی از این است که اسید های آمینه باردار دارای فراوانی بالایی بخصوص در نواحی سطحی پروتئین های گرما دوست می باشند. همچنین مطالعات قبلی بیانگر این است که جهش زایی در جایگاه 300 آنزیم لوسیفراز برخصوصیات سیننتکی وپایداری تاثیر می گذارد . به منظور ارزیابی اثر بارهای سطحی اسیدهای آمینه باردار و نقش جایگاه 300 )که در لوپ سطحی واقع شده است ( بر پایداری آنزیم لوسیفراز، جهش زایی در لوسیفراز lampyris turkestanicus به صورت جهش های منفرد l300r,l300k,l300e انجام شد. بیان و تخلیص هر دو لوسیفراز طبیعی و جهش یافته جهت مطالعه ویژگیهای سنتتیکی و ساختاری صورت گرفت. طیف سنجی نشری بیانگر این است که جایگزینی این اسید آمینه با اسیدهای آمینه باردار در 7.8=ph بر روی ماکزیمم طول نشری فاقد اثر است. افزایش فعالیت ویژه لوسیفراز برایe l300k,l300 نیز مشهود است. جهش زایی l300r با افزایش دمای بهینه همراه بود. بررسی فعالیت باقی مانده نسبی درشرایط 35 درجه بمدت 60 دقیقه بیانگر افزایش فعالیت باقی مانده در جهش یافته l300r,l300k نسبت به نمونه طبیعی بوده است.