بهینه سازی تولید هورمون رشد انسانی نوترکیب در سلول های cho و مقایسه فعالیت زیستی آن با نوع پروکاریوتیک هورمون رشد
چکیده
هورمون رشد انسانی (hgh) یک زنجیره پلی پپتیدی منفرد شامل 191 اسیدآمینه است و توسط سلول های سوماتوتروف غده هیپوفیز تولید و ترشح می شود. سلول های پستانداران در مقایسه با سایر میزبان ها از جمله باکتری ها، به خاطر توانایی شان در ایجاد ساختار صحیح پروتئین، تجمع و اصلاحات پس از ترجمه ای، سیستم مطلوب برای تولید پروتئین های نوترکیب با کاربردهای کلینیکی هستند. امروزه با وجود در دسترس بودن رده های سلولی فراوان، نزدیک به 70% پروتئین های نوترکیب درمانی در سلول های تخمدان همستر چینی (cho) تولید می شوند. با این وجود، میزان تولید در سلول های پستانداران در مقایسه با میزبان های پروکاریوتی پایین است. افزایش تولید هورمون رشد انسانی نوترکیب در سلول های cho برای توسعه یک فرایند زیستی کارامد در مقیاس وسیع ضرور ی است. در محیط های مرسوم کشت سلول های پستانداران از سرم به عنوان مکمل استفاده می شود؛ با این وجود استفاده از سرم نگرانی هایی از قبیل هزینه بالا، مداخله در خالص سازی محصولات نوترکیب و امکان آلودگی های ویروسی را در پی دارد. بنابراین استفاده از محیط فاقد سرم مزایای زیادی برای محصولات ترشحی از قبیل هورمون رشد دارد. سنجش گزارشگر ژنی مثل سیستم گزارشگر لوسیفراز به طور وسیعی برای مطالعه ی بیان و تنظیم ژن های یوکاریوتی به کار می رود. اگرچه ژن های گزارشگر کاربردهای زیادی دارند اما اغلب به عنوان شاخص فعالیت رونویسی در سلول ها بکار می روند، بنابراین سیستم -های گزارشگر برای تعیین فعالیت زیستی مولکول ها از قبیل هورمون رشد کاربرد دارند. در مطالعه ی حاضر، ابتدا rhgh در سلول-های یوکاریوتی cho در محیط حاوی سرم تولید شد و تولید rhgh توسط الایزا، دات بلات و وسترن بلات مورد ارزیابی قرار گرفت. سلول های cho تولید کننده rhgh برای رشد در محیط فاقد سرم با استفاده از روش های سازگاری مستقیم و تدریجی تطابق پیدا کردند. سپس، تأثیر تیمارهای مختلف شامل غلظت های مختلف گلیسرول، دی متیل سولفوکساید (dmso)، سدیم بوتیرات (nabu)، سولفات روی (znso4) و تأثیر دما در تولید rhgh در سلول های cho مورد بررسی قرار گرفتند و تولید gh توسط تکنیک الایزا مورد ارزیابی قرار گرفت. در نهایت فعالیت زیستی rhgh با استفاده از ترانسفکشن همزمان سیستم ژن گزارشگر lhre-tk-luciferase با وکتور حاوی cdna رسپتور gh انسانی در سلول های hek-293 مورد ارزیابی قرار گرفت. در این مطالعه تولید rhgh در سلول های cho از طریق کنترل شرایط کشت افزایش پیدا کرد. سلول های cho در محیط فاقد سرم رشد کردند و rhgh در این محیط تولید شد. در ادامه سلول های cho توانایی رشد به حالت سوسپانسیون به جای کشت چسبنده را یافتند. تولید rhgh در سلول های cho در حالت سوسپانسیون با تولید در محیط های کامل حاوی سرم قابل مقایسه است. نتایج بیواسی نشان داد rhgh تولید شده توسط سلول های cho قادر است مسیر سیگنالینگ سلولی هورموی رشد را القا کند و فعالیت زیستی بالاتری نسبت به gh پروکاریوت و مشابه نمونه تجاری gh است. این یافته ها نشان دادند که کنترل شرایط کشت سلولی از قبیل اضافه کردن ترکیبات شیمیایی و کنترل دما به توسعه یک فرایند صنعتی و در مقیاس وسیع به تولید rhgh کمک می کند. همچنین کشت سوسپانسیون سلول های cho در محیط فاقد سرم را می توان با موفقیت بدست آورد که این امر تأثیر مهمی بر فرایندهای خالص سازی دارد. rhgh در رده سلولی پستانداران با فعالیت زیستی بالا می تواند تولید شود. سیستم گزارشگر ژنی یک روش بسیار حساس، کارا، دقیق و ایمن برای بررسی فعالیت زیستی پروتئین های نوترکیب مثل rhgh می باشد.