غربالگری باکتری های متیلوتروف و توسعه تکنیک های dna بیوسنسور و فاژ تایپینگ برای تشخیص آن ها
چکیده
شواهدی وجود دارد که نشان می دهد بین افزایش ابتلا به سرطان و کلر زنی آب آشامیدنی به دلیل تولید ترکیبات تری هالومتان (مانند کلروفرم) در این فرایند، ارتباط مستقیم وجود دارد. انواع خاصی از باکتری های متیلوتروف می توانند این ترکیبات را مصرف کنند. بنابراین حضور این باکتری ها در آب آشامیدنی تصفیه شده احتمال وجود این مواد در آب را مطرح می کند و وجود بیوفیلم ها در سیستم های فرسوده توزیع آب به حضور پایدارتر آن ها کمک می کند. نمونه های مختلفی از آب تصفیه شده شهر، فیلترهای خانگی تصفیه آب و آب رودخانه برای بررسی حضور این باکتری ها و مطالعه تنوع متیلوتروف ها در محیط های آبی مورد ارزیابی قرار گرفتند. با استفاده از روش mpn (most probable number) در محیط پایه حاوی متانول وجود این باکتری ها در آب شهر تایید و تعداد تقریبی آن ها mpn index/l 77/0 تعیین شد. در ادامه 30 باکتری جداسازی شدند که پس از رنگ آمیزی و انجام آزمایش های بیوشیمیایی با غربالگری اولیه 8 باکتری مختلف از میان آن ها انتخاب شدند. برای شناسایی دقیق آن ها از تکثیر و تعیین توالی ژن 16s rdna استفاده شد و با توجه به نتایج جستجوی توالی ها در بانک ژن این باکتری ها شامل یک متیلوتروف اجباری (methylobacillus flagellatus) و هفت متیلوتروف اختیاری (xantomonas campestris ، delftia acidivorans، raoultella ornithinolytica، methylobacterium extorquens، microbacterium oxydans، stenotrophomonas maltophilia و delftia sp.) بودند. از این نتایج برای ترسیم درخت و مشخص نمودن ارتباط فیلوژنتیک آن ها استفاده شد. در مرحله بعد برای غربالگری باکتری های مصرف کننده هالومتان از بین متیلوتروف های جداسازی شده و تایید حضور این باکتری ها در آب به عنوان نشانه ای از وجود هالومتان ها، توانایی آن ها در مصرف ترکیبات کلردار متان (دی کلرومتان و کلروفرم) با استفاده از اندازه گیری مقدار کلر آزاد شده، بررسی کاهش ph محیط به روش رنگ سنجی و سنجش میزان فرمالدئید تولید شده مورد ارزیابی قرار گرفت. از چهار باکتری که توانایی مصرف این ترکیبات را داشتند methylobacterium extorquens با آزاد کردن mg/l 33 کلر از کلروفرم و تولید mm 136/0 فرمالدئید از دی کلرومتان بهترین عملکرد را داشت. پس از تایید حضور باکتری های متیلوتروف در آب، هدف بعدی ارزیابی و انتخاب روشی برای شناسایی سریع باکتری های جداسازی شده بود. به این منظور کارایی ftir به عنوان تکنیکی مطرح برای شناسایی و تفکیک باکتری ها مورد بررسی قرار گرفت. بعد از انجام آزمایشات (حداقل با سه تکرار) برای هر نمونه، آنالیزهای آماری بر روی طیف های ftir با استفاده از نرم افزار spss نتایج نشان داد که این روش علاوه بر سریعتر و کم هزینه تر بودن نسبت به روش تعیین توالی 16s rdna از نظر نتیجه کاملاً با این روش قابل مقایسه است و دندروگرام ترسیم شده با این روش نیز شباهت بسیار زیادی به درخت فیلوژنتیک ترسیم شده با استفاده از توالی ژن 16s rdna داشت. یکی از اهداف اصلی این تحقیق، یافتن روشی برای تشخیص سریع حضور این باکتری ها بود. بررسی های انجام شده در این راستا نشان داد که علی رغم گسترش روزافزون dna بیوسنسورها به عنوان یکی از ابزارهای تشخیصی سریع و قابل اطمینان، گزارشی از ساخت و کاربرد dna بیوسنسور برای باکتری های متیلوتروف وجود ندارد. به همین دلیل بیوسنسوری برای آن ها طراحی و کارایی آن ارزیابی شد. در طراحی این dna بیوسنسور الکتروشیمیایی از ژن cmua (ژن شاخص باکتری های مصرف کننده ترکیبات کلردار متان) به عنوان ژن هدف برای طراحی پروب استفاده شد. مولکول تک رشته ای dna پروب با استفاده از چیتوسان بر روی الکترودی از جنس شیشه پوشیده شده با fto لایه نشانی و تثبیت شد. پس از انجام هیبریداسیون با dna هدف اختصاصی (محصول pcr ژن cmua) و نمونه های شاهد، با استفاده از فروسنیوم هگزا فلوروفسفات به عنوان نشانگر هیبریداسیون و با تکنیک cv و swv تغییرات پیک جریان در الکترودها بررسی شد. در مجموع سیستم طراحی شده عملکرد قابل قبولی در شناسایی باکتری با استفاده از محصول pcr ژن مورد نظر داشت. به دلیل اینکه فاژها به عنوان یکی از ابزارهای تشخیصی (در روش فاژتایپینگ) در شناسایی باکتری ها مورد استفاده قرار می گیرند و از عوامل مهم اکولوژیک در کنترل جمعیت های باکتریایی محسوب می شوند، همچنین با توجه به اینکه گزارش های معدودی در مورد باکتریوفاژهای آلوده کننده باکتری های متیلوتروف وجود دارد، هدف بعدی جداسازی و مطالعه این فاژها بود. برای جداسازی فاژها نمونه های مختلفی از آب و پساب مورد آزمایش قرار گرفت. پس از غنی سازی اولیه، وجود فاژ در نمونه ها با spot test تایید شد و در مراحل بعد با توجه به ویژگی های پلاک ها در مجموع 5 فاژ جداسازی شد و پس از خالص سازی و تهیه تصویر میکروسکوپ الکترونی میزان جذب آن ها تعیین و منحنی رشد یک مرحله ای برای هر کدام ترسیم شد. آنگاه ژنوم فاژها استخراج و الگوی برش آنزیمی هر کدام مشخص و بخشی از ژنوم، پس از کلونینگ تعیین توالی شد. همچنین توالی ژنوم کامل یکی از فاژها نیز مشخص گردید. نتایج نشان داد که از 5 فاژ جداسازی شده 3 فاژ (که میزبان آن ها باکتری raoultella بود) متعلق به خانواده myoviridae بودند و دو فاژ دیگر (که از باکتری microbacterium جداسازی شده بودند) از خانواده siphoviridae بوده که یکی از آن ها پس از تعیین توالی کل ژنوم به عنوان اولین فاژ لیتیک جداسازی شده برای این باکتری گزارش گردید. تعیین گستره میزبانی فاژهای جداسازی شده یا به عبارت دیگر فاژتایپینگ باکتری ها نشان داد که آن ها به جز باکتری های میزبان قادر به آلوده کردن باکتری های دیگر نبودند. بنابراین این فاژها می توانند به عنوان فاژ تیپ تنها برای فاژتایپینگ سویه های میزبان استفاده شوند. علاوه بر این فاژ مربوط به microbacterium به دلیل لیتیک بودن می تواند برای کنترل جمعیت این باکتری مورد استفاده قرار گیرد.