جداسازی، شناسایی و همسانه¬سازی ژن pr10 ذرت، بیان پروکاریوتی آن و مطالعه اثر ضد قارچی پروتئین pr10 بیان شده
چکیده
با روند افزایشی جمعیت کره زمین، کمبود محصولات کشاورزی به یک نگرانی مهم تبدیل شده است. از جمله عوامل کاهش این محصولات عوامل بیماریزای گیاهی به ویژه حملات قارچی می باشد. گیاهان راه کارهای گوناگونی برای مقابله با عوامل بیماریزا دارند که از آن جمله می توان به پپتیدهای ضدمیکروبی اشاره کرد. در این میان پروتئین های وابسته به پاتوژن )پروتئین های (pr، دارای اهمیت ویژه ای می باشند. خانواده pr10 از مهمترین اعضای این گروه می باشد که تا کنون فعالیت های ضدقارچی، ضدباکتریایی و ضدویروسی اعضای مختلف این خانواده اثبات شده است. در این تحقیق به پروتئین pr10 ذرت پرداخته و فعالیت ضدقارچی آن بر انواع قارچ های بیماریزای گیاهی بررسی شد. بدین منظور ژن pr10 ذرت از dna ژنومی و cdna گیاه zea mays استخراج و به ترتیب در ناقل های pjet1.2 و ptz57r/t همسانه¬سازی شد. پس از تأیید همسانه¬سازی، cdna ژن pr10 توسط هضم آنزیمی از سازه نوترکیبptznz1 خارج و در ناقل بیانی پروکاریوتی pet26 b(+) زیرهمسانه¬سازی و تأیید شد. پس از انتقال سازه نوترکیب petnz1 به میزبان بیانی e. coli rosetta(de3) و e. coli bl21(de3) مراحل بهینه سازی بیان انجام و پروتئین بیان شده توسط روش وسترن بلات تأئید شد. مکان یابی پروتئین حاکی از بیان آن به صورت inclusion body بود که بر روی آن مراحل واسرشتگی، بازآرایی و دیالیز انجام شد. در نهایت با استفاده از روش کروماتوگرافی میل ترکیبی توسط ستون ni-nta، پروتئین نوترکیب pr10 تخلیص شده و غلظت آن به روش برادفورد تعیین شد. عملکرد پروتئین نوترکیب توسط آزمون هضم dna مورد ارزیابی قرار گرفت. در ادامه به منظور بررسی فعالیت پروتئین pr10 ذرت در برابر قارچ¬های بیماری¬زای botrytis cinerea، sclerotinia sclerotiorum، fusarium oxysporum، verticillium dahlia و alternaria solani، از آزمون¬های زیست¬سنجی radial diffusion assay، disk diffusion assay و spore germination assay استفاده شد. نتایج این آزمون ها حاکی از فعالیت بازدارندگی پروتئین pr10 ذرت در برابر قارچ های آزموده شده می باشد. همچنین نتیجه آزمون ایمنی زیستی همولیز حاکی از آن بود که پروتئین نوترکیب بیان شده برای سلول¬های پستانداران سمی نیست.