شناسایی گونه های غالب aspergillus و penicillium روی محصول انگور کشمشی تازه و خشک شده در منطقه جنوب آذربایجان شرقی با استفاده از روش های ریخت شناختی و مولکولی و بررسی پتانسیل توکسین زایی آن ها
چکیده
انگور و فراورده های آن نقش مهمی را در اقتصاد ایران ایفا می کنند. مطابق گزارش فائو در سال 2012 ایران با تولید حدود 2150 هزار تن انگور در مقام نهم دنیا قرار داشت. مطابق گزارش موسسه استاندارد و تحقیقات صنعتی ایران در پایان سال 1389 از میزان 350 هزار تن صادرات خشکبار کشور، حدود 90 هزارتن به صادرات کشمش اختصاص داشت. گونه های جنس aspergillus، انگور را در مرحله قبل و بعد از برداشت آلوده می کنند. چندین گونه از جنس aspergillus از جمله aspergillus niger و گونه های مرتبط با آن از عوامل قارچی دخیل در پوسیدگی خوشه انگور و آلوده کننده ی فرآورده های آن به شمار می روند. جنس penicillium، یک جنس قارچی همه جازی است که دارای بیش از 255 گونه ی پذیرفته شده می باشد. چندین گونه از جنس penicillium در بین عمومی ترین عوامل بیماری زای پس از برداشت قرار داشته و روی دامنه ی وسیعی از میوه ها و سبزیجات، بیماری ایجاد می نمایند. آلودگی به گونه های مختلف این دو جنس قارچی ضمن کاستن از کیفیت و کمیت انگور و فرآورده های آن با صدمه زدن به حبه ها و تخریب آن ها، باعث تولید و تجمع زهرابه هایی نظیر اکراتوکسین-آ و پاتولین می گردند. با این وجود اطلاعات زیادی در مورد گونه های متعلق به جنس های aspergillus و penicillium در انگور و فرآورده های آن در ایران در دسترس نمی باشد. تحقیق حاضر با هدف شناسایی گونه های متعلق به جنس های aspergillus و penicillium روی انگور و کشمش در شهرستان های جنوبی استان آذربایجان شرقی با استفاده از داده های ریخت شناختی و مولکولی انجام گرفت. نمونه برداری از انگور تازه و کشمش جمع آوری شده از باغات و کارخانجات فرآوری انگور صورت گرفت. جداسازی جدایه های قارچی با استفاده از روش های اتاقک مرطوب و کشت روی محیط کشت سیب زمینی دکستروز آگار و خالص سازی جدایه های قارچی با استفاده از کشت نوک ریسه انجام گرفت. شناسایی ریخت شناختی با کشت روی محیط کشت های زاپک آگار، زاپک مخمر آگار، زاپک مخمر با 20% ساکارز، سیب زمینی دکستروز آگار، عصاره مالت آگار و عصاره مخمر ساکارز آگار و شناسایی مولکولی بر اساس توالی یابی ژن های بتاتوبولین و کالمودالین برای جدایه های منتخب انجام شد. برای ارزیابی تولید سم قارچی، جدایه های مختلف هر دو جنس aspergillus و penicillium روی محیط های کشت czapek yeast autolysate agar (cya) و coconut cream agar (cca) کشت گردیدند و به مدت سه و هفت روز در دمای 25 درجه ی سلسیوس نگهداری شدند. برای استخراج سم قارچی از محیط کشت جدایه های قارچی و حبه های انگور و کشمش به ترتیب از روش ارایه شده توسط اسمدگارد (smedgaard, 1997) و مک دونالد و همکاران (macdonald et al., 1999) استفاده گردید. برای ارزیابی تولید سم قارچی از چهار روش استفاده از بخار آمونیاک، عکس برداری با اشعه ی ماورای بنفش، کروماتوگرافی لایه نازک (tlc) و کروماتوگرافی مایع با کارآیی بالا (hplc) استفاده گردید. در این تحقیق از مجموع 270 نمونه ی انگور تازه و کشمش، تعداد 193 جدایه ی متعلق به جنس aspergillus و 66 جدایه ی متعلق به جنس penicillium جداسازی گردید. بر اساس مطالعات ریخت شناختی و مولکولی (ترادف یابی ژن های بتاتوبولین و کالمودولین) تعداد چهار گونه از جنس aspergillus شامل گونه های a. niger، a. tubingensis، a. uvarum و a. welwitschiae شناسایی گردیدند، این گونه ها متعلق به aspergillus section nigri بودند. در این مطالعه گونه ی aspergillus tubingensis با فراوانی 94 درصد به عنوان گونه ی غالب جنس aspergillus مشخص گردید. هم چنین تعداد نه گونه از جنس penicillium شامل گونه های p. brevicompactum، p. cf. crocicola، p. crustosum، p. expansum، p. glabrum، p. olsonii، p. sumatrense، talaromyces atroroseus و t. minioluteus شناسایی شدند که به زیرجنس های aspergilloides (با فراوانی 23%)، biverticillium (با فراوانی 38%) و penicillium (با فراوانی 39%) تعلق داشتند و گونه ی p. expansum با فراوانی 3/33 درصد به عنوان گونه ی غالب از جنس penicillium مشخص شد. نتایج ارزیابی روش های مختلف سنجش تولید سموم قارچی در جدایه ها نشان داد که روش های مختلف کارآیی متفاوتی را در ردیابی تولید سم قارچی دارند به طوری که تولید اکراتوکسین-آ با استفاده از روش بخار آمونیاک، عکس برداری با اشعه ی ماورای بنفش و hplc به ترتیب در 69%، 41% و 65% از جدایه ها قابل تشخیص بود. میزان هم خوانی روش بخار آمونیاک با hplc، hplc با عکس برداری با اشعه ی ماورای بنفش، بخار آمونیاک با عکس برداری با اشعه ی ماورای بنفش و سه روش مذکور با هم دیگر به ترتیب 50%، 69%، 62% و 42% بود. بر اساس نتایج این تحقیق کارآیی عکس برداری با اشعه ی ماورای بنفش در مقایسه با بخار آمونیاک در ردیابی جدایه های توکسین زای a. tubingensis بیش تر بود. میزان سم قارچی تولید شده توسط جدایه های قارچی با استفاده از hplc بین 29 تا 1089 میکروگرم بر کیلوگرم تعیین گردید. نتایج ما هم چنین نشان داد که با استفاده از روش های آزمایش شده در این تحقیق، تولید اکراتوکسین-آ و پاتولین در جدایه های متعلق به جنس penicillium قابل ردیابی نبود. این بررسی اولین گزارش از گونه ی a. tubingensis از انگور و کشمش از این منطقه، اولین گزارش از وقوع گونه ی a. welwitschiae در انگور و نیز اولین گزارش از شیوع گونه ی a. uvarum از انگور در ایران می باشد، هم چنین بجز دو گونه ی p. brevicompactum و p. expansum، بقیه ی گونه های متعلق به جنس penicillium که در این تحقیق شناسایی شدند، برای اولین بار از ایران و از انگور گزارش می گردند.