ساخت کاست rnai برای زیر واحد امگا گلیادین در گندم
چکیده
امگاگلیادین ها 5 تا 10 درصد از پروتئین های آرد گندم را شامل می شوند. مشخصه بارزی که در ژن های امگا گلیادین وجود دارد و می توان بهآن اشاره داشت وجود توالی های تکراری و فاقد اینترون می باشد. حدود 80 درصد از بیماری آنافیلاکسی ورزشی ناشی از گلیادین های گندم می باشد. همچنین گلیادین ها باعث بیماری های سلیاک و اسکلروزیس متعدد نیز می شوند. تنها راه درمان این بیماری ها رژیم غذایی فاقد گلوتن می باشد. بدلیل طاقت فرسا بودن این شیوه درمان، به نظر می رسد یکی از بهترین روش ها ممانعت از تولید امگا گلیادین با استفاده از تکنیک rnai باشد. گام نخست در این راه ساخت کاست های اختصاصی امگا گلیادین می باشد. در این پژوهش ابتدا به جداسازی قطعات مورد نیاز ژنی امگا گلیادین اقدام و سپس ساخت سازه پلاسمیدی حاوی دو قطعه سنس و آنتی سنس از ژن امگا گلیادین در پلاسمید ptg19-t انجام گرفت. در ابتدا توالی نوکلئوتیدی ژن امگا گلیادین با شماره دسترسی kf412579 به کمک نرم افزارهای blastn ، clustalw برای همردیفی و انتخاب بهترین ناحیه مورد استفاده قرار گرفت. در طراحی پرایمر اختصاصی برای تکثیر ناحیه انتخاب شده از نرم افزارهایprimr3 و oligo7 استفاده شد. پس از pcr و جداسازی قطعه ژنی امگا گلیادین و خالص سازی آن از ژل آگارز در پلاسمید ptg19-t همسانه سازی شد. بعد از تعیین توالی یابی و صحت 99 درصدی از ژن کلون شده شرایط برای ساخت پرایمر اختصاصی قطعه کوچک نیز فراهم شد. قطعه کوچک که همان آنتی سنس هم گفته می شود در اتصال دوباره به پلاسمید ptg19-t درست در جایگاه قطعه بزرگ ولی برعکس آن همسانه سازی شد تا شرایط برای ساخت rnai که ویژگی دو رشته ای شدن mrna بعد از رونویسی و از بین بردن ژن امگا گلیادین با پروتئین های موجود در سلول را دارد مهیا شد.