جداسازی ژن مقاومت به شوری از ریز جلبک دونالیلا و همسانه سازی آن در وکتور کلونینگ جهت انتقال و ایجاد مقاومت به شوری در گیاهان
چکیده
شوری خاک از مهمترین عوامل محدود کننده بهره برداری از اراضی زراعی جهان است که سبب کاهش تولیدات کشاورزی و کاهش رشد گیاهان می¬شود. یکی از خصوصیات سلول¬های گیاهان متحمل به شوری، توانایی آنها در دفع سدیم به خارج از سلول به کمک پمپ¬های پروتونی غشای سلولی می¬باشد. ریز جلبک دونالیلا سالینا مقاوم¬ترین موجود یوکاریوت نسبت به شوری است و قادر است محیط¬های شور کلرور سدیم را تا حد اشباع تحمل نماید. در این مطالعه جلبک دونالیلا در محیط کشت تغییر یافته¬ی جانسون کشت داده شد و سپس dnaی ژنومی جلبک به دو روش دلاپورتای تغییر یافته و روش گومز و گنزالس استخراج گردید و کیفیت و کمیت آن بررسی شد. جهت جدا سازی ژن pm-h+-atpaseکه کد کننده یک پمپ پروتونی در غشای سلولی این جلبک می¬باشد، یک جفت آغازگر اختصاصی به نام های fh+ و rh+ طراحی گردید و با استفاده از روش واکنش زنجیره¬ای پلیمراز(pcr) و به کمک دستگاه ترموسایکلر ژنpm-h+-atpase تکثیر گردید. پس از الکتروفورز و مشاهده محصول pcr، باند bp 3400 این ژن روی ژل آگارز، از روی ژل تخلیص گردید و واکنش اتصال با ناقل پلاسمیدی ptg19/t صورت پذیرفت و درون آن همسانه¬سازی گردید. ناقل حامل ژن pm-h+-atpase، به سلول های مستعد باکتری e.coli منتقل گردید و در این مرحله باکتری¬ها روی محیط حاوی آنتی بیوتیک آمپی¬سیلین رشد داده شدند و به کمک تکنیک colony pcr، کلونی¬های مثبت انتخاب شدند. سپس یکی از کلونی¬های انتخابی در محیط کشت lb مایع کشت داده شد و سپس به روش لیز قلیایی پلاسمیدهای نوترکیب استخراج شدند. و در آخر به منظور اطمینان از صحت همسانه سازی واکنش هضم آنزیمی با آنزیم¬های برشی afliiو spei بر روی ناقل نو ترکیب انجام شد.