مطالعه متابولیت های ثانویه و بیان ژن های مسیر فنیل پروپانوئید و آنتی اکسیدان های آنزیمی گیاه بومادران در شرایط تنش خشکی

شیما غریبی

چکیده

ایران دارای ذخایر ارزشمند ژنتیکی از بسیاری گیاهان دارویی می باشد. بومادران (achillea) گیاهی است از زیرخانواده anthemideae و خانواده asteraceae که بیش از 100 گونه در جهان دارد. نوزده گونه آن درمناطق مختلف ایران پراکنده شده اند. این گونه ها خواص دارویی متعددی دارند و می توانند در فضای سبز مناطق خشک مورد استفاده قرار گیرند. خشکی از جمله تنش های فیزیکی است که به عنوان مهم ترین عامل محدود کننده رشد و تولید گیاهان در اکثر نقاط جهان و ایران شناخته شده است. تنش های محیطی سبب بروز اختلالات متابولیسمی در سلول های گیاهی می گردند که یکی از عوامل اصلی این اختلالات افزایش تولید انواع گونه های فعال اکسیژن (ros) می باشد. گیاهان می‏توانند توسط سیستم های آنتی-اکسیدانی آنزیمی و غیرآنزیمی اثرات مخرب گونه های فعال اکسیژن را کاهش دهند. علاوه بر این، تجمع رادیکال های آزاد باعث افزایش فلاونوئیدها و اسیدهای فنولیک در سلول گیاهی می شود، زیرا این ترکیبات از خاصیت آنتی اکسیدانی بالایی برخوردار هستند. در این پژوهش میزان تحمل به خشکی 20 ژنوتیپ از هفت گونه achillea (a. millefolium, a. pachycephala, a. aucherii, a. tenuifolia, a. kellalensis, a. filipendulina, a. nobilis) و تغییرات میزان متابولیت های ثانویه این گیاهان در سطوح مختلف آبیاری بررسی شد. آزمایش به صورت فاکتوریل 4×20 در قالب طرح بلوک کاملا تصادفی با سه تکرار انجام شد که در آن ژنوتیپ ها در چهار سطح آبیاری ارزیابی شدند. نتایج نشان داد که ژنوتیپ a.pachycephala از منطقه سلفچگان دارای بیشترین میزان ترکیبات فنولیک، فلاونوئید و فعالیت آنتی اکسیدانی در مقایسه با سایر ژنوتیپ ها در شرایط تنش و غیر تنش بود، درحالی که دو گونه a. kellalensis و a. nobilis کمترین مقادیر ترکیبات ذکر شده را داشتند. علاوه بر این، دو گونه a. pachycephala و a. aucherii بیشترین قدرت زنده مانی را در شرایط تنش نشان دادند. بنابراین، به منظور انجام مطالعات مولکولی گونه a. pachycephala انتخاب گردید. در این بخش از پژوهش، هشت ژن مربوط به آنتی اکسیدان های آنزیمی(apx1، gpx1، cat2، dhar، mdar، fe-sod، gr1 وaox1) و هفت ژن دخیل در مسیر سنتز فلاونوئیدها (chi1،chs1، pal2، f3h1، f3h1، f35h و fls1) ردیابی و شناسایی شدند. سپس نواحی انتخابی و حفاظت شده هر ژن در سایر گونه های گیاهی شناسایی و در گیاه بومادران توالی یابی گردید. تغییرات بیان ژن های مذکور در شرایط تنش و در بازه های زمانی هفت روزه با آزمایش real time pcr مورد بررسی قرار گرفت. همچنین جهت بررسی روند تغییرات محصولات این ژن ها در شرایط تنش، فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانی سنجیده شد و غلظت اسیدهای فنولیک و فلاونوئیدها با دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا(hplc) مورد بررسی قرار گرفت. در روزهای نخست تنش خشکی، گیاه با افزایش بیان ژن های آنتی اکسیدانی آنزیمی، سیستم دفاعی اولیه خود را فعال کرد. در روز هفتم غلظت رادیکال آزاد پراکسید هیدروژن نسبت به نمونه شاهد افزایش قابل توجهی داشت. در روزهای چهاردهم و بیست ویکم بیان ژن های آنتی اکسیدان های آنزیمی به صورت معنی داری از سایر بازه های زمانی بالاتر بود. در روز بیست و هشتم فعالیت این آنزیم ها به موازات به حداکثر رسیدن غلظت h2o2 در سلول ها به بیشترین میزان خود رسید. آزمایش hplc در گیاه بومادران ده ترکیب مهم دارویی را مشخص ساخت. در مجموع، در روز بیست و یکم پس از شروع تنش میزان کلروژنیک اسید، پی کوماریک اسید، روتین، لوتئولین 7-اوگلیکوزاید، 1،3 دی کافئولکوئینیک اسید، لوتئولین، آپی ژنین و کائمفرول به حداکثر میزان خود در مقایسه با نمونه شاهد رسیدند و با گذشت زمان در روز بیست و هشتم علی رغم بیان بالاتر ژن های مسیر فنیل پروپانوئید از غلظت این ترکیبات کاسته شد. بنابراین، در طول 21 روز دوره کم آبی، گیاه با تغییرات بیان ژن ها و فعال ساختن سیستم اولیه دفاعی، سعی در مبارزه با تنش اکسیداتیو می نماید. با طولانی تر شدن دوره تنش گیاه وادار به استفاده از سیستم ثانویه دفاعی(آنتی اکسیدان های غیر آنزیمی) می شود. مکانیسم های پیچیده سلولی تا قبل از شدید شدن تنش با تغییر بیان ژن های مسیر فنیل پروپانوئید باعث ذخیره اسیدهای فنولیک و فلاونوئیدها در گیاه شد. با فعال شدن سیستم ثانویه دفاعی این ترکیبات مهم دارویی با خاصیت آنتی اکسیدانی خود به مبارزه با ros می پردازند. بنابراین، این ترکیبلات در روز 28 ام اکسید شده و از میزان آنها کاسته می شود.

اساتید راهنما و مشاور

قدرت الله سعیدی، بدرالدین‏‎‎‏ ابراهیم سیدطباطبایی، سید امیرحسین گلی، مجید طالبی