بیان فاکتور رونویسی دوپامینرژیکی nurr۱ در سلولهای انسانی بهوسیله لنتی ویروسهای نوترکیب
چکیده
هدف: هدف این تحقیق تولید لنتی ویروسهای حامل ژن nurr1 و بیان در سلولهای انسانی میباشد. مواد و روشها: قطعه ژنی ires-egfp با آنزیمهای bgl ll/not1 از ناقل pires2-egfp جدا و با klenow کور (blunt) گردید. ناقل لنتی ویروسی pnl-egfp/cmv/wpredu3 با آنزیمهای nhe1/ xho1 برش و دو سر آن کور شد. قطعه ژنی ایزوله شده به این ناقل منتقل شد تا سازه لنتی ویروسی (i) بهوجود آید. سپس ژن nurr1 با آنزیمهای xho1 و bamh1 از ناقل pcmx-not بریده و درون پلاسمید (i) خطی شده باsal1 و bamh1 منتقل شد تا سازه نهایی لنتی ویروسی (ii) تولید گردد. برای تولید لنتی ویروسهای نوترکیب، رده سلول انسانی hek-293t را با این پلاسمید نهایی، بههمراه پلاسمیدهای غشایی و بسته بندی لنتی ویروس ترانسفکت شد. محیط این سلولها که مملو از ذرات ویروسی شده بود جمع آوری و از ستون آمیکون عبور داده شد تا ذخیره غلیظ ویروس بهدست آید. این ذخیره برای آلوده سازی سلولهای هدف استفاده شد. بیان egfp در زیر میکروسکوپ به اثبات رسید و بیان ژن nurr1 با rt-pcr سنجیده شد. نتایج: درستی مراحل کلونینگ با آنزیمهای مربوطه اثبات شد. با میکروسکوپ فلورسنس بیان enhanced green fluorescent protein (egfp) در هر دو مرحله ترانسفکشن و ترانسدوکشن ثابت گردید. تکنیک rt-pcr بیان nurr1 را در هردو مرحله به اثبات رسانید. نتیجه گیری: لنتی ویروسهای ناقل ژن انسانی nurr1 تولید شده و بهدنبال آلوده سازی سلولهای انسانی hek-293t با ویروسهای مزبور، سلولهای فوق ژن nurr1 را بهطور موفقیت آمیز بیان کردند.