همسانه سازی ژن lysa در راستای افزایش تولید اسیدآمینه l- لیزین
چکیده
l – لیزین یکی از 9 اسیدهای آمینه ضروری است که در تغذیه انسان و دام اهمیت بسزایی دارد. این اسیدآمینه به دلیل کاربرد بسیار در صنایع دارویی و غذایی حائز اهمیت می باشد. در سال های اخیر تقاضا برای این محصول افزایش یافته و این منجر به گسترش تحقیقات برای تولید صنعتی این اسیدآمینه شده است. سالانه صدها هزار تن l- لیزین بوسیله corynebacterium glutamicum در جهان تولید می شود. corynebacterium glutamicum یک باکتری گرم مثبت، هوازی، غیربیماریزا و خاکزی است. c.glutamicum atcc 21799 اگزوتروف به اسیدآمینه لوسین و پنتوتنات و مقاوم به آمینواتیل سیستئین، e.coli bl21(de3) و e.coli dh5? در این طرح تحقیقاتی مورد استفاده قرار گرفتند. در این طرح dna کروموزومی از سویه c.glutamicum atcc 21799 استخراج شد و ژن lysa (کد کننده آنزیم دی آمینوپیمیلات دکربوکسیلاز) بوسیله آنزیم pfuپلیمراز و پرایمرهای طراحی شده با استفاده از واکنش زنجیره ای پلیمراز (pcr) از خزانه ژنی جدا شده و در وکتورptz57r/t کلون گردید. پلاسمید نوترکیب به روش شک حرارتی در e.coli dh5? حساس شده به روش cacl2 ترانسفورم شد. کلونی های سفید رشد یافته بر روی محیط x-gal حاوی پلاسمید نوترکیب بودند. پلاسمیدهای نوترکیب به منظور تعیین ترادف و برش آنزیمی مناسب توسط آنزیم های hindiiiو nhei استخراج گردیدند و پس از هضم آنزیمی وکتور بیانی pet28a بوسیله آنزیم های مشابه، واکنش لیگاسیون صورت گرفت و در نهایت در میزبان بیانی e.coli bl21(de3) ترانسفورم شد. کلون باکتریایی نوترکیب با دو روش شناسایی واکنش pcr و هضم آنزیمی تائید گردید. پروتئین نوترکیب بوسیله sds-page بررسی شد. و سنجش اسیدآمینه l- لیزین با استفاده از روش چینارد صورت گرفت. نتایج نشان داد که بیان آنزیم دی آمینوپیمیلات دکربوکسیلاز افزایش یافته، اطلاعات و داده های بدست آمده در طرح حاضر موجود است.