همسانه سازی و انتقال ژن لوسیفراز حشره شبتاب (lampyris turkestanicus) به گیاه توتون (nicotiana tabacum)
چکیده
" کشاورزی مولکولی" به تولید پروتئین های دارویی و آنزیم های صنعتی ارزشمند در گیاهان از طریق مهندسی ژنتیک اطلاق می شود. آنزیم لوسیفراز حشره شبتاب یکی از مهمترین آنزیم های صنعتی است که به طور وسیعی در زمینه های مختلف بیوتکنولوژی و بیولوژی سلولی و مولکولی بویژه در تشخیص میزان atp به منظور تشخیص آلودگی های میکروبی، تهیه کیت های تشخیص سرطان، غربالگری داروها، زیست حسگرها، همچنین در بررسی روابط برهمکنشی و تاخوردگی پروتئین ها، سنجش های آنزیمی و توالی یابی dna (pyrosequencing) استفاده می شود. ژن لوسیفراز نیز به عنوان ژن گزارشگر ایده آل در مهندسی ژنتیک به منظور بهینه سازی سیستم انتقال ژن، کاربرد فراوان دارد. تحقیق حاضر جهت انتقال ژن لوسیفراز حشره شبتاب گونه ایرانی lampyris turkestanicus و تولید آن در گیاه توتون انجام گرفت. در این تحقیق، ژن لوسیفراز حشره شبتاب (luc) به کمک باکتریagrobacterium tumefaciens سوش lba4404 به گیاه توتون کولتیوار xanthi منتقل شد. آغازگرهای مناسب با توجه به توالی های انتهای َ3 و َ5 ژن لوسیفراز، محل های برشی ncoi و bsteii و توالی افزایش دهنده سیستم بیان گیاهی (kozak sequence) طراحی شدند. ژن مورد نظر به کمک pcr با آغازگرهای اختصاصی جداسازی و پس از عملیات هضم آنزیمی و اتصال (ligation)، در ناقل بیانی pcambia1304 همسانه سازی شد. به منظور اطمینان از همسانه سازی ژن مذکور، سازه تهیه شده با استفاده از تکنیک های مختلف مانند colony pcr، pcr ، هضم آنزیمی، توالی یابی و همردیف سازی آن در بانک اطلاعاتی (genbank)، مورد تایید قرار گرفت. سپس سازه تهیه شده توسط روش ذوب و انجماد به باکتری آگروباکتریوم منتقل شد. جهت آلوده سازی گیاهان توتون، از ریزنمونه های برگی استفاده شد. ریزنمونه¬های تلقیح شده توسط آگروباکتریوم، به محیط های کشت انتخابی حاوی آنتی بیوتیک های هیگرومایسین و سفوتاکسیم منتقل شدند. گیاهچه¬¬¬¬¬¬های باززایی شده بر روی محیط کشت انتخابی، جداسازی و به محیط کشت ریشه زایی انتقال یافتند. گیاهچه ها پس از ریشه دار شدن، ابتدا به گلدان حاوی پرلایت و در نهایت به خاک منتقل شدند. بررسی مولکولی pcr با استفاده از آغازگرهای اختصاصی¬، بر روی dna ژنومی استخراج شده از گیاهان باززایی شده، تراریخت بودن آنها را تایید نمود. از گیاهان شاهد غیرتراریخت به عنوان کنترل منفی pcr استفاده گردید.
