خالص سازی یک آنتی بادی نوترکیب بر علیه گیرنده هورمون لپتین و مقایسه خصوصیات فیزیولوژیک آن با نوع طبیعی
چکیده
پس از تائید اولین آنتی بادی نوترکیب انسانی شده برای مصرف انسان توسط سازمان غذا و دارو آمریکا (fda) عرصه جدیدی در تحقیقات بیوتکنولوژیک برای تولید این دارو ها گشوده شد. آنتی بادی های نوترکیب آنتی بادی هایی هستند که توسط میکروارگانیسم های ترانسفورم شده با پلاسمید حاوی توالی آنتی بادی مورد نظر تولید می شوند. این آنتی بادی ها به دلیل در اختیار بودن توالی اسید هسته ای آنها قابل دستورزی از جهات گوناگون مانند افزایش تمایل، اتصال به مولکولهای دیگر، آنتی بادی با خاصیت دوگانه و انسانی سازی می باشند. لپتین هورمونی مشتق شده از سلول های چربی است، که از مدت ها قبل نقش آن به عنوان یک فاکتور کلیدی در محدوده وسیعی از پاسخ های بی‍ولوژیکی مشخص شده است. علاوه بر این اعمال، دارای نقشی شبیه به سایتوکاین های پیش التهابی است. برای مثال تمایز سلولهای th1 وتولید سایتوکاین توسط آنها را تحریک می کند. شواهدی وجود دارد که نشان می دهد لپتین در بروز و میزان حساسیت به بیماری های خود ایمن دخالت دارد. مهار کردن گیرنده لپتین احتمالا می تواند باعث تغییر در پاسخ ایمنی و کاهش اثرات مخرب ناشی از بیماری های خود ایمن گردد. بدین جهت در این تحقیق تولید آنتی بادی نوترکیب بر علیه گیرنده لپتین که برای ایجاد تغییرات مورد نظر قابلیت دستورزی داشته باشد و بتواند از طریق اتصال به گیرنده لپتین آن را بلوکه نماید مد نظر قرار گرفت. برای تولید آنتی بادی نوترکیب از توالی قسمت fab مولکول آنتی بادی cdna سلولهای هیبریدومای تولید کننده آنتی بادی ضد گیرنده لپتین که قبلا تکثیر و استخراج شده و در وکتور بیانی pcomb3 وارد گردیده بود استفاده شد. برای انجام ترانسفورماسیون ابتدا سلولهای مستعد e.coli از سویه jm109 به روش کلرید کلسیم تهیه شدند. سپس با کمک روش شوک گرمایی ترانسفورماسیون این سویه انجام شد. برای تولید آنتی بادی نوترکیب از محیط کشت lb که حاوی ?g/ml100 آمپی سیلین و 1 میلی مولارiptg بود استفاده شد. تولید آنتی بادی نوترکیب ترشح شده با کمک تکنیک های dot blot و western blot مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. از آنجایی که آنتی بادی نوترکیب تولید شده دارای توالی his-tag بود، خالص سازی آن با استفاده از ستون نیکل و ایمیدازول صورت گرفت. در مرحله بعد بررسی اتصال آنتی بادی نوترکیب تولید شده به گیرنده لپتین و نیز مقایسه آن با آنتی بادی مونوکلونال ضد گیرنده لپتین از طریق آزمون الایزا صورت گرفت. نتایج حاکی از تولید موفقیت آمیز قطعهfab نوترکیب آنتی بادی توسط e. coli jm109 می باشد. نتایج توسط دو تکنیک western blotو dot blotنشان داده شد. نتایج با کمک آنالیز وسترن بلات، باند هایی با وزن مولکولی حدود kda 50 که برابر با وزن مولکولی fab است را نشان داد. بنابراین e.coli سویه jm109 ترانسفورمه شده توانایی تولید آنتی بادی نوترکیب بر علیه گیرنده لپتین را دارد. نتایج حاصل از آزمون الایزا نشان داد که آنتی بادی نوترکیب تولید شده توانایی اتصال به گیرنده لپتین را دارد.