بهینه سازی تولید یک آنتی بادی با اختصاصیت دوگانه علیه گیرنده لپتین و cd4 و بررسی خواص آن
چکیده
موش¬های دچار نقص لپتین، (هورمون پروتئینی با وزن مولکولی 16 کیلو دالتون،) به القای هر دو نوع فعال و اکتسابی انسفالومیلیت خودایمن تجربی، eae (مدل حیوانی بیماری مالتیپل اسکلروزیس) مقاومت دارند که این مقاومت با تجویز لپتین قابل برگشت بوده. به طور کلی لپتین باعث افزایش واسطه¬های ایمنی سلولی و تمایز لنفوسیت tcd4+ به سمت th1 میشود. موش¬هایی که سلول¬های cd4+ t آن¬ها، تحت تاثیر آنتاگونیست¬های لپتین قرار گرفته، یک کاهش حساسیت نسبت به پپتید عامل القاء eae از خود نشان دادند. در نتیجه با استفاده از آنتاگونیستی برای ممانعت از عمل لپتین بر سلول¬ها، تا حد زیادی می¬توان بیماری¬های خودایمن را درمان کرد. از طرفی لپتین یک هورمون (سایتوکاین) چند منظوره و دارای اثرات متعدد از جمله در متابولسیم و تعادل انرژی است؛ بنابراین لازم است برای تعدیل اثرات لپتین منحصراً در سیستم ایمنی، آن را فقط به سمت سلول¬های t سوق دهیم؛ tafv (tandem single chain fragment variable: tandem scfv) طراحی شده در پژوهش قبلی با ویژگی دوگانه همزمان، علیه گیرنده سلول¬های t، cd4، و علیه گیرنده لپتین به این منظور تولید شده. هدف از این پژوهش بهینه¬سازی شرایط برای تولید مقادیر افزوده از این مولکول بود. به این منظور ژن tafvِ کلون شده به وکتورهای pet32a و pet26b ساب¬کلون و سپس آزمایش¬های بهینه-سازی تولید محصول بر روی آن انجام شد. برای وارد کردن ژن tafv به وکتورهای pet32a و pet26b هر دو وکتور مبدأ (pab1) و هدف با آنزیم¬های noti- hindiii و ncoi -ecori در واکنش¬های دابل دایجست بریده شدند و سپس واکنش الحاق بین قطعه و وکتورهای هدف صورت گرفت. قطعه¬ی tafv همراه با pelb وارد وکتور pet32a شد و وکتور pet26b خود دارای قطعه¬ی pelb بود. حضور قطعه tafv در وکتور pet32a با انجام pcr به کمک پرایمرهای t7 تأیید شد. بعد از ترانسفورماسیون سویه¬های باکتری e.coli و بیان پروتئین، آزمایش¬های دات¬بلات و وسترن¬بلات برای اطمینان از بیان پروتئین توسط آنتی¬بادی anti his- hrp انجام شد. تمام آزمایش¬های بررسی حضور پروتئین بر روی قسمت¬های سیتوپلاسم و پری¬پلاسم باکتری-ها انجام گرفت. برای دستیابی به عصاره¬ی پری¬پلاسمی، از شیب سوکروز (بافر x1 و x 5/1 تریس، edta و سوکروز) و برای دستیابی به عصاره¬ی سیتوپلاسمی از امواج اولتراسوند (سونیکاتور)، بهره برده شد. سری آزمایش¬های بهینه¬سازی (18 آزمایش)، با 4 فاکتور که فاکتور محیط کشت دارای 6 سطح و سایر فاکتورها یعنی دما، سویه¬ی باکتریایی و غلظت iptg هر کدام دارای 3 سطح بودند، پس از طراحی توسط نرم¬افزار مینی¬تب، با 3 بار تکرار انجام شد. (سطوح فاکتورها به این شرح بود: محیط¬های کشت tb حاوی گلیسرول m0.6، lb حاوی سوربیتول m 0.5، sb حاوی سوربیتول m 0.5، lb حاوی گلایسین و تریتون 100 – x هر کدام 1%، sb حاوی گلایسین و تریتون 100 – x هر کدام 1%، tb حاوی گلیسرول m0.6 و اتانول 3%. ، دماهای 18، 23 و ˚c 30، سویه¬های e.coli bl21, jm109, origami و غلظت¬های0.05, 0.1, 1mm iptg). به منظور مقایسه¬ی میزان پروتئین تولید شده، تست الایزا روی آن¬ها انجام شد. برای تست الایزا به علت فقدان استاندارد تجاری، پروتئین¬های تولید شده به عنوان استاندارد به کار برده شدند. به این ترتیب که از بخشی از آن¬ها بعد از خالص¬سازی و تغلیظ، سری رقت تهیه شد و توسط تست بردفورد مقدارشان تعیین و به عنوان استاندارد برای آزمایش¬های الایزا به کار برده شدند و مقایسه پروتئین تولید در مقادیر مختلف انجام گرفت. به منظور خالص¬سازی از دو نوع ستون نیکل ni-nta و کارتریج 300 نوواجن بهره برده شد. این نتیجه حاصل شد که احتمالاً محیط¬های حاوی سوربیتول و همین¬طور محیط¬های tb، دمای ˚c 18، سویه¬ی e.coli bl21 و غلظت iptg 0.05mm برای بیان پروتئین مناسب¬تر از سایر سطوح¬اند. غلظت تقریبی پروتئین تولید شده ml/ µg 26.67 برآورد شد. در نهایت میزان کارایی یا اتصال پروتئین خالص شده به cd4 روی لنفوسیت¬ها مورد ارزیابی قرار گرفت که در کنار کنترل مثبتِ anti human cd4 fitc که قادر به اتصال به 24% لنفوسیت¬ها بود، قابلیت اتصال tafv تولید شده در بیشترین حالت به حدود 20 % از لنفوسیت¬ها نشان داده شد.