جداسازی و شناسایی مخمرهای تولید کننده اسید سیتریک از منابع متفاوت
چکیده
اسید سیتریک، یک محصول صنعتی با کاربرد بسیارگسترده است.. به واسطه انحلال پذیری بالا در آب، طعم ترش مطبوع، خاصیت سمی بسیار کم و جذب آسان، خواص بافری و همچنین شرکت در سنتزهای شیمیایی در صنایع غذایی، داروسازی ، آرایشی و بهداشتی و دیگر صنایع کاربرد فراوانی دارد. پیش بینی می شد تولید جهانی اسید سیتریک در سال 2009 به بیش از 2 میلیون تن برسد. تا حدود سال 1965آسپرژیلوس نایژر تنها ارگانیسم انحصاری برای تولید اسید سیتریک بود اما از آن سال به بعد با شناخت مخمر های تولید کننده این اسید؛ مطالعه بر روی آن ها در جهت تولید اسید سیتریک افزایش چشمگیری داشته است. استفاده از آسپرژیلوس نایژر برای تولید اسید سیتریک با مشکلات محیطی بسیاری همراه است و ضمناً پساب هایی با میزان بالای فلزات سنگین را ایجاد می نماید. مزیت مخمرها نسبت به قارچ های کپکی رشد بر روی انواع سوبستراهای ارزان قیمت و قابل دسترس از جمله هیدروکربن ها وترکیبات نفتی است .از دیگر مزایای مخمر ها این است که می توانند مقادیر بالای قند را تحمل کنند و در نتیجه تغییرات ترکیب محیط کشت در مورد آن ها راحت تر صورت می گیرد. علاوه بر آن ، حساسیت کم آنها به یون های فلزات موجود در مواد اولیه خام، باعث شده که تیمار اولیه مخمر ها جهت تولید خیلی هزینه زا نباشد. این تحقیق برای نخستین بار جداسازی مخمر ها را با هدف تولید اسید سیتریک مورد بررسی قرار می دهد. از آن جا که اسید سیتریک در طی سیکل کربس در هر موجود زنده ای تولید می شود در نتیجه نمی توان برای جداسازی سویه های تولید کننده آن، منبع مشخص و معینی را ذکر نمود؛ بنابر این جداسازی مخمرهای یاروویا لیپولیتیکا به عنوان بهترین مخمرهای تولید کننده اسید سیتریک، از منابع متفاوت لبنی و گوشتی در اولویت کار قرار گرفت. بعد از نمونه گیری از کارخانه شیر پگاه و شرکت فراورده های پروتئینی راک اصفهان و جمع آوری نمونه های مختلف دیگر، جداسازی بیش از 340 سویه مخمر بر روی محیط های اختصاصی صورت گرفت و سپس غربالگری اولیه بر روی محیط حاوی برموکروزول ارغوانی ، انجام پذیرفت . در نهایت 12 سویه که بهترین قطر هاله را به کلنی داشتند؛ غربالگری شدند. آزمایش ها در محیط تولید در شرایط کشت بسته(منقطع) ادامه یافت و بررسی میزان تولید اسید سیتریک از طریق روش کالریمتریک و همچنین روش آنزیمی با کیت، در طول زمان 192 ساعت هر 24 ساعت یک بار انجام شد و بهترین زمان تولید ساعت 144 تعیین گردید. در پایان از بین سویه های غربال شده سویه ای از ناگت مرغ به دست آمد که با بازده gcit/gglc 55/0 به عنوان یکی از بهترین سویه های وحشی تا به امروز شناخته شده در تولید اسید سیتریک معرفی می شود. با بررسی تست های بیوشیمیایی و استفاده از روش مولکولی pcr، این سویه مورد شناسایی قرار گرفته و از انواع یاروویا لیپولیتیکا شناخته شد. لازم به ذکر است در طول مراحل کار از یک سویه استاندارد خوب تولید کننده اسید سیتریک yarrowia lipolytica dsm3286 نیز بهره گرفته شد و سویه جداشده m7 yarrowia lipolytica از نظر بازده تولید اسید سیتریک و وزن خشک به دست آمده در ساعت اوج تولید از این سویه نیز برتر بود. با بهینه سازی های انجام شده مشخص شد در غلظت های بالای گلوکز در کشت بسته، تولید در هر دو سویه پایین می آید و بهترین غلظت تولید اسید در سویه m7 حدود 10 درصد و در dsm3286 حدود 5 درصد تعیین شد؛ ضمن اینکه از بین انواع منابع کربن مورد آزمایش، بازده تولید اسید در m7 و dsm3286 به ترتیب در روغن زیتون حدود g/g 62/0 و g/g 35/0 و در گلیسرول به ترتیب g/g 27/0 و g/g 23/0 به دست آمد. نتایج این تحقیق نشان داد کاهش غلظت نیتروژن باعت بالارفتن معنادار تولید اسید سیتریک می گردد و نسبت c/n در تولید اسید سیتریک توسط مخمر ها از فاکتور های بسیار مهم است. بهترین منبع نیتروژن آلی در سویه m7 سویا و در مورد dsm3286 عصاره مخمر شناخته شد و بهترین ph برای شروع تولید، حدود 5/6 به دست آمد. نکته مهمی که در نتیجه این تحقیق برای اولین بار به آن پی برده شد این بود که افزودن موادی مانند سورفکتانت ها که نفوذپذیری غشاء را در نیمه رشد لگاریتمی تحت تأثیر قرار می دهند، مانند تریتون100- x با غلظت 2 درصد می تواند بازده تولید اسید سیتریک را تا حدود 5/1 برابر افزایش دهد. استفاده از ویسکوزکننده های مختلف نیز آشکار ساخت غلظت های خاص از بعضی مواد مثل آگار، پلی اتیلین گلیکول وcmc بسته به نوع سویه می تواند بازده تولید اسید سیتریک را به طور چشمگیر و معناداری افزایش دهد. جداسازی سویه های مناسب جهت کار های میکروبیولوژی صنعتی و بیوتکنولوژی اولین گام در شروع یک تحقیق بنیادی و کاربردی است، از آن جا که این سویه از انواع یاروویا لیپولیتیکا شناخته شد که از جمله مخمر های غیر معمول با قابلیت های بسیار بالاهستند، می توان بر روی توانمندی های احتمالی دیگر آن مانند تولید آنزیم ها ، اسید ها و متابولیت های دیگر و همچنین تولید بیوسورفکتانت و توانایی حذف فلزات و آلودگی های نفتی و ... از پساب ها و نیز قابلیت استفاده از آن به عنوان کواستارتر در پنیر سازی تحقیقات مناسب و هدفمندی را انجام داد.