بررسی تولید آنزیم لیپاز و اسید سیتریک در مخمر یاروویا لیپولیتیکا و بهینه سازی تولید با استفاده از روش های مهندسی متابولیک
چکیده
مخمر یاروویا لیپولیتیکا سوبستراهای آب گریز نظیر آلکان ها، اسیدهای چرب، چربی ها و روغن ها را برای تولید اسیدهای آلی، آنزیم های لیپاز، پروتئین و روغن تک یاخته به خوبی تجزیه می نمایند. هدف این تحقیق بررسی تولید و بهینه سازی لیپاز خارج سلولی و اسید سیتریک به عنوان متابولیت های با ارزش از لحاظ زیست فناوری از سوبسترا های ارزان قیمت و تجدیدپذیر است. از بین روغن های گیاهی آزمایش شده به عنوان منبع کربن، روغن زیتون بهترین محیط برای تولید لیپاز و اسید سیتریک بود. سویه dsm 3286 مخمر یاروویا لیپولیتیکا در این محیط حدود 6/34 واحد در میلی لیتر آنزیم لیپاز و همچنین اسید سیتریک و پروتئین تک یاخته به عنوان محصول جانبی در این محیط به همراه عصاره مخمر تولید کرد. به منظور به دست آوردن سویه های مخمر تولیدکننده آنزیم لیپاز در سطح بالا، سویه dsm 3286 مخمر یاروویا لیپولیتیکا تحت جهش زایی با اتیل متان سولفونات و اشعه uv قرار گرفت. 20 سویه از بین 1600 جهش یافته تیمار شده با اتیل متان سولفونات و اشعه uv براساس قابلیت بالای تولید لیپاز بر روی محیط انتخابی گزینش شدند. محیط کشت صنعتی جدیدی حاوی متیل اولئات برای تولید لیپاز بهینه شد، زیرا متیل اولئات یک ترکیب ارزان قیمت و جایگزین خوبی در فرآیند تولید صنعتی است. در فرمنتور 20 لیتری حاوی محیط صنعتی جدید یکی از جهش یافته های uv پس از 24 ساعت 356 واحد در میلی لیتر (حدود 5/10 برابر نسبت به سویه وحشی) تولید نمود. برای فرآیند پایین دستی فرمول های مختلفی از مواد افزودنی به منظور خشک کردن پاششی و انجمادی لیپاز استفاده شد و سپس اثر ph ، دما و زمان ذخیره سازی بر فعالیت پودرهای آنزیمی به دست آمده بررسی گردید. توالی نوکلئوتید ژن لیپاز خارج سلولی نوع دو(lip2) در سویه وحشی و جهش یافته تعیین شد، تجزیه و تحلیل در بین توالی دو ژن تشابه زیادی نشان داد. فقط دو جایگزینی در موقعیت 362 و 385 در ناحیه اصلی کد کننده آنزیم لیپاز مشاهده شد. همچنین دو جایگزینی و دو افزایش نوکلئوتید t در ناحیه پروموتوری تعیین گردید. این اطلاعات اهداف خوبی را برای نوترکیبی dna و مهندسی متابولیک معکوس لیپاز خارج سلولی مخمر یاروویا لیپولیتیکا نشان می دهد. علاوه بر این مدل سازی سه بعدی پروتئین لیپازهای وحشی و جهش یافته تهیه و همولوژی آنها مقایسه شدند. تجزیه و تحلیل ساختارهای دوم نشان داد که آنزیم ها مشابه ساختار لیپازهای معمول دارای یک هسته محافظت شده از لحاظ ساختاری هستند که از هشت صفحه بتا موازی تشکیل شدند که با مارپیچ های آلفا از دو طرف احاطه شدند. در نهایت حامل های fdp100 و fdp101 ساخته شدند که به ترتیب دارای ژن لیپاز وحشی و جهش یافته هستند. این حامل ها را می توان به منظور بررسی بیان و مقایسه لیپازهای وحشی و جهش یافته در سایر میزبان ها استفاده نمود.