استفاده از اکورین بعنوان آنزیم گزارشگر نوین: مطالعات جهش زایی و آنالیز سینتیک آن در شناسایی ترکیبات نیتروآروماتیک
چکیده
اکورین فوتوپروتئینی است که اولین بار از نوعی عروس دریایی بنام aequoera victoria کشف شد، که قادر است از خود نور آبی رنگ ساطع نماید. بدلیل حساسیت بالای اکورین به غلظت کلسیم و با توجه به اینکه در این پروتئین، درصد سیگنال نسبت به نویز پس زمینه، بسیار بالا است ، از این فوتوپروتئین در حوزه های مختلف زیست فناوری استفاده های زیادی می شود. در این پژوهش طی سه مرحله بر روی این پروتئین تحقیقات صورت گرفت: 1- فوتوپروتئین نوترکیب، در سیستم بیانی pet 21a(+) کلون و بیان گردید. پس از خالص سازی ، اکورین نوترکیب مورد آنالیز ساختاری ، سینتیکی ، پایداری حرارتی، خاموش کنندگی و پروتئازی در حضور چند پایدارکننده قرار گرفت. نتایج حاصله بیانگر افزایش پایداری و فعالیت اکورین تولیدی در حضور سوربیتول با کمترین تاثیر در هضم پروتئازی و خاموش کنندگی با آکریل آمید می باشد. 2- جهش های شیفت نوری و تغییر زمان تضعیف نشر نور در سه جهش y82f، w86f و d153g بصورت تک و دوتایی صورت گرفت. براین اساس شش پروتئین جهش یافته با نامهای aeq-82 ، aeq-86 ، aeq-153 ، aeq-82/86 ، aeq-82/153 و aeq-86/153 بدست آمد. در ادامه جهش های حاصله از نظر شیفت نوری، مدت زمان تضعیف نشر نور و پایداری حرارتی مورد آنالیز قرار گرفتند. نتایج بدست آمده نشان داد بیشترین طول موج نشر نوری از 457 نانومتر(aeq.) به 400 (aeq-82/86) و 478 (aeq-82 و aeq-82/153)نانومترتغییر یافته است. از سوی دیگر t1/2 یعنی مدت زمانی که فعالیت فوتوپروتئین، به 50 درصد اولیه می رسد، از 0.7 ثانیه(aeq.) به 3.7 (aeq-82)ثانیه افزایش یافته است. همچنین بنظر می رسد دو جهش aeq-86 و aeq-82/153 ، سبب افزایش پایداری حرارتی پروتئین در استرس دمایی 65 درجه سانتی گراد به مدت 30 دقیقه، شده است. 3- در بخش سوم از تحقیقات، از اکورین بعنوان آنزیم گزارشگر جهت شناسایی ترکیبات آروماتیک نظیر تولوئن و بنزن در قالب یک حسگر زیستی باکتریای استفاده شد. در این پژوهش از اجزاء اپرون xyl موجود در باکتری سودوموناس پوتیدا mt-2 استفاده گردید. به این صورت کهcdna فاکتور فعال کننده نسخه برداری یعنی xylr که در حضور ترکیبات آروماتیک فعال می شود و در دانشگاه مالک اشتر در داخل پلاسمید pgl2 کلون و با نام pgl2-px ثبت گردیده بود، مورد استفاده قرار گرفت. از سوی دیگر، بعد از پروموتور pu (که بوسیله پروتئین xylr فعال می شود) فوتوپروتئین اکورین همراه یا بدون حضور توالی شاین دالگارنو (sd) یا توالی ختم رونویسی rrnb)) در منطقه بالادستی آن کلون گردید. سپس پلاسمید طراحی شده در درون باکتری jm109 ،ترانسفورم گردید. به این ترتیب نوعی حسگر زیستی بر مبنای باکتری jm109 طراحی و بدست آمد. حسگر باکتریایی تولیدی در ادامه مورد آنالیز فعالیت براساس غلظت های متفاوت تولوئن و ترکیبات مشابه قرار گرفت. نتایج حاصله بیانگر مناسب بودن این حسگر باکتریایی جهت جایگزینی آن به جای روش های مرسوم شیمیایی نظیر کروماتوگرافی فشار بالا (hplc) می باشد.