طراحی پل دی سولفیدی در آنزیم لوسیفراز با استفاده از تکنیک جهش زایی هدفدار جهت تولید گزارشگر مناسب در مطالعه نانو سیستم های زیستی
چکیده
آنزیم لوسیفراز حشره شب تاب در طی دو مرحله، مرحله اول با نقش لیگازی با استفاده از atp و mg2+ و مرحله دوم با نقش مونواکسیژنازی و با استفاده از o2 باعث تبدیل سوبسترای خود، لوسیفرین به ترکیب برانگیخته اکسی لوسیفرین می شود که در هنگام برگشت به حالت پایه ایجاد نور با بازده کوانتومی بالا می کند. به دلیل کاربردهای فراوان صنعتی و تشخیصی آنزیم لوسیفراز، جهش های زیادی برای افزایش پایداری حرارتی و بهبود ویژگی های سینتیکی و ساختاری آن انجام شده است. علیرغم افزایش پایداری حرارتی در تولید این نوع جهش یافته ها مشاهده شده است که مقدار km برای هر دو سوبسترای لوسیفرین و atp تا حدودی افزایش می یابد و یا فعالیت ویژه آنزیم بطور چشمگیری کاهش پیدا می کند. از طرفی مشخص شده است که پیوند دی سولفیدی با کاهش آنتروپی حالت فولدنشده (unfold) نقش مهمی در پایداری پروتئین-های پایدار بازی می کند. تاکنون هیچ گزارشی مبنی بر حضور پیوند دی سولفیدی در گونه های حشرات شب-تاب وجود ندارد. به همین دلیل در این مطالعه به منظور افزایش پایداری آنزیم لوسیفراز حشره شب تاب گونه آمریکای شمالی (فوتینوس پیرالیس) و ایجاد یک آنزیم جهش یافته با ویژگی های جدید، چهار جایگاه به منظور ایجاد چهار جهش یافته با یک پیوند دی سولفید و با تلفیق آنها دو پروتئین با دو پیوند دی سولفید ایجاد شد و سپس توسط روش جهش زایی هدفدار ژن کدکننده لوسیفراز تغییر داده شد و بعد از بیان و تخلیص شش آنزیم جهش یافته، ویژگی های سینتیکی و ساختاری آنها مورد مطالعه قرار گرفت. به علاوه یکی از موتانت ها c81-a105c به فرم ترشحی در آمد و فعالیت آن در سلولهای یوکاریوتی مور مطالعه قرار گرفت. نتایج نشان داد که پیوند دی سولفید سبب شیفت نوری به ناحیه قرمز و افزایش دمای بهینه به اندازه 15 درجه سانتی گراد در بعضی از جهش ها نسبت به نمونه وحشی شده است. همچنین مطالعات ترمودینامیک تعادلی در حضور اوره، نشاندهنده افزایش پایداری ترمودینامیکی در نمونه های حاوی جهش (افزایش 2/7 کیلوژول بر مول در میزان ?gu) می باشد. بنابراین فرم ترشحی لوسیفراز، با ویژگیهای افزایش دمای بهینه، پایداری سینتیکی و ترمودینامیکی و شیفت نوری به سمت قرمز، برای مطالعات بررسی بیان ژن و غربالگری در مقیاس زیاد مناسب می باشد