بررسی اثرات بارهای سطحی آرژنین بر ساختار و عملکرد آنزیم لوسیفراز از طریق جهش زایی هدفدار
چکیده
لوسیفراز حشره شب تاب یک آنزیم مونواکسیژناز بوده و در حضور atp، لوسیفرین را به لوسیفریل-آدنیلات تبدیل نموده که در یک واکنش چند مرحله ای، به حالت برانگیخته اکسی لوسیفرین تبدیل می شود. با برگشت اکسی لوسیفرین برانگیخته به حالت پایه، تولید نور سبز رنگ می نماید. نور تولید شده توسط این آنزیم، یکی از حساس ترین ابزارهای تشخیص دقیق atp بوده و به منظور اندازه گیری آلودگیهای میکروبی، سنجش گزارشگرهای ژنتیکی در بیولوژی مولکولی و در تعیین توالی dna استفاده می شود. با این حال، آنزیم لوسیفراز بسیار ناپایدار است و به سرعت فعالیت خود را حتی در دمای اتاق از دست می دهد. این امر منجر به از دست رفتن حساسیت و دقت کاربردهای تشخیصی آنزیم می شود. به همین دلیل به منظور استفاده بیشتر از این آنزیم و توسعه این فناوری، تلاشهای بسیاری با جهش زایی هدفدار برای جداسازی یک نمونه جهش یافته با ویژگی های مناسب انجام شده است. مطالعات مهندسی پروتئین نشان داده است که پروتئین های گرمادوست، دارای فراوانی بیشتری از اسیدهای آمینه آرژنین به ویژه در نواحی سطحی می باشند. به منظور بررسی اثر ایجاد بارهای سطحی آرژنین بر پایداری آنزیم لوسیفراز و مطالعه بیشتر نقش لوپ ها در پایداری آنزیم، تعدادی از اسیدهای آمینه سطحی در معرض حلال در آنزیم لوسیفراز lampyris turkestanicus به آرژنین تغییر داده شدند. همه این اسیدهای آمینه در بخش لوپ های سطحی آنزیم لوسیفراز l. tu قرار دارند. جهش های اولیه بر روی نمونه های جهش یافته e354q/arg356 و e354r/arg356 و بصورت جهش های منفرد q35r، i182r، i232r و l300r و سپس جهش های دوتایی q35r/i232r و جهش های سه تایی q35r/i232r/i182r ایجاد شدند. لوسیفرازهای طبیعی و جهش یافته، بیان و تخلیص شده و ویژگیهای سینتیکی و ساختاری آنها مورد مطالعه قرار گرفت. طیف های نشری بیولومینسانس نشان می دهند که جایگزینی این اسیدهای آمینه با آرژنین، اثری بر ماکزیمم طول موج نشری آنزیم ندارد. همچنین جهش یافته های دوگانه e354q/arg356 و سه گانه q35r/i232r/i182r فعالیت ویژه لوسیفراز را حفظ کرده اند. با افزودن آرژنین، دمای بهینه فعالیت جهش یافته های i232r ، e354q/arg356 و q35r/i232r/i182r به °c 40 افزایش یافته که °c 15 بیشتر از لوسیفراز طبیعی می باشد. همچنین، بعد از نگهداری نمودن نمونه ها به مدت 40 دقیقه در دمای °c40، فعالیت باقی مانده نسبی آنزیم طبیعی فقط در حدود 5% فعالیت اولیه آن می باشد در صورتیکه فعالیت باقی مانده برای نمونه های i232r ، e354q/arg356 و q35r/i232r/i182r به ترتیب در حدود 60، 80 و 80 درصد فعالیت اولیه می باشد.