بررسی نقش ef-hand i در ساختار و عملکرد فتوپروتئین mnemiopsin ازکتنوفورmnemiopsis leidyi با استفاده از جهش زایی هدفدار
چکیده
به فرآیند تبدیل انرژی شیمیایی به انرژی مرئی نورانی توسط موجودات زنده بیولومنیسانس گویند و امروزه با توجه به بالا بودن درصد سیگنال فوتون به نویز پس زمینه، بیولومینسانس کاربرد های زیادی در حوزه های مختلف علوم زیستی پیدا نموده است. تا کنون هشت نوع فتوپروتئین وابسته به کلسیم گزارش شده که از این میان تنها فتوپروتئین نمیوپسین از شانه دار mnemiopsis leidyi تعیین توالی و بصورت نوترکیب بیان نشده است. در این تحقیق، بعد از جمع آوری شانه دار نمیوپسیس لیدی از دریای خزر و انجام فرایند های استخراج rna، ساخت cdna، طراحی پرایمر، pcr، t/a cloning، subcloning در وکتور بیانی pet28a و انتقال به سویه بیانی bl21(de3)، توالی ژنی بدست آمده در بانک ژنی با کد دسترسی gq884175 ثبت گردید. نتایج حاصل از تعیین توالی بیانگر جایگزینی گلوتامیک اسید به جای گلایسین حفاظت شده در لوپef-hand اول نمیوپسین بود بنابراین بررسی این تغییرات بر عملکرد پروتئین می توانست قابل توجه باشد از این رو با استفاده از جهش زایی هدف دار، جهش e50g انجام شد. سپس به تعیین ویژگیهای فتوپروتئین نوترکیب طبیعی و جهش یافته نظیر ph مطلوب، دمای مطلوب، شرایط بیانی مطلوب ( میزان بیان در دما ها، زمان ها و غلظت های مختلف القاء کننده ها)، میزان حساسیت به کلسیم، شرایط انکوباسیون (مدت زمان انکوباسیون و غلظت کلنترازین) پرداخته شد. نتایج نشان دادند که بیان پروتئین در دمای 30 درجه سانتی گراد، با 6 ساعت انکوباسیون بعد القاء در غلظت یک میلی مولار iptg افزایش یافته است. نتایج تعیین ویژگی فتوپروتئین طبیعی و جهش یافته، بیانگر حساسیت فوق العاده زیاد نمیوپسین طبیعی و جهش یافته به تغییرات ph می باشد. به طوری که میزان فعالیت فتوپروتئین ها در ph برابر 9 تا حد قابل ملاحظه ای با سایر ph ها متفاوت است علت این حساسیت با استفاده از بررسی تغییرات pka در ph مختلف با استفاده از نرم افزار macrodox در مقایسه با فتوپروتئین آکورین توجیه گردید. همچنین بررسی ها نشان دادند که مدت زمان لازم برای بازسازی و همچنین غلظت مطلوب کلنترازین نمیوپسین در مقایسه با آکورین بیشتر می باشد که بررسی توالی و ساختار نمیوپسین با آکورین نیز علت این تفاوت را روشن نمود. ادامه بررسی ها نیز کاهش میزان حساسیت به کلسیم نمیوپسین نوترکیب طبیعی و جهش یافته در مقایسه با آکورین را تائید کردند. آنالیز توالی نمیوپسین و نتایج motif scan نشان داد که در نمیوپسین طبیعی لوپ ef-hand اول قابلیت اتصال به کلسیم خود را از دست داده است و هر چند میزان حساسیت به کلسیم نمیوپسین جهش یافته نسبت به طبیعی افزایش یافته اما در مقایسه با اکورین همچنان حساسیت پایین می باشد. بررسی بهترین دمای لازم جهت فعالیت پروتئین ها نشان دهنده حساسیت به دما در این پروتئین ها می باشد. با استفاده از مطالعات ساختاری، نظیر دورنگ نمایی دورانی، فلورسانس و ft-ir، ساختار دوم و سوم پروتئین ها بررسی و نتایج نشان دهنده افزایش فشردگی ساختار نمیوپسین جهش یافته نسبت به طبیعی و افزایش چرخش بتا نمیوپسین جهش یافته و کاهش پیچه نامنظم آن بودند. در نهایت با استفاده از همولوژی مدلینگ، مدل نمیوپسین نوترکیب طبیعی، جهش یافته و آکورین در حضور کلسیم و کلنترازین برای استفاده در محاسبات تئوری ساخته شد.