کلونینگ،تعیین ترادف? بیان و بررسی خصوصیات بیوشیمیایی آنزیم لاکاز جداشده از یک سویه باسیلوسی
چکیده
لاکازها (1.10.3.2 ;ec پارا دی فنول دی اکسیژن اکسیدوردوکتاز) بدلیل قابلیت اکسیداسیون طیف گسترده ای از ترکیبات فنولی کاربردهای زیادی در صنایع بیوتکنولوژی دارد. در این تحقیق ژن لاکاز از bacillus sp. hr03 بوسیله پرایمرهای کلونینگ تکثیر و سپس محصولات pcr در ناقل بیانی (pet21a) کلون و به باکتری e.coli سویه bl21 انتقال یافت و آنالیز توالی انجام گرفت. ژن لاکاز حاوی 1542 نوکلئوتید بوده و 514 اسید آمینه را کد می کند. cota جدا شده از bacillus hr03 2/98% شباهت و 8/98% همسانی را با cota از باسیلوس سوبتیلیس نشان می دهد. بمنظور بدست آوردن مقادیر بالای پروتئین محلول بیان تحت شرایط میکروآئروبیک و در دمای پایین انجام گرفت. پروتئین نوترکیب بوسیله ستون q-sepharose تخلیص و وزن مولکولی آنزیم بوسیله sds-page 65 کیلو دالتون تعیین گردید. خصوصیات بیوشیمیایی آنزیم با استفاده از سه سوبسترای معمول لاکاز 2, 2?-azino-bis(3-ethylbenzothioazolin-6-sulphonic acid) (abts)، syringaldazine (sgz) و2, 6-dimethoxyphenol (2, 6-dmp) انجام گرفت. km و kcat به ترتیب در هنگامیکه واکنشها در دمای اتاق انجام گرفت برای abts -µm 535 و s-1 127، برای µm 2, 6-dmp 53 و s-1 3 و برای sgz µm 5 و s-1 20 تعیین گردید. بعلاوه ما اثر nacl را بر فعالیت لاکاز بررسی کردیم که با افزایش غلظت nacl فعالیت کاهش پیدا می کند.