کلونینگ، تعیین ترادف، بیان و خالص سازی پیروات کیناز جداشده از سویه ژئوباسیلوس بومی ایران
چکیده
adp در بسیاری از واکنش های بیولوژیک شرکت می کند و کیت سنجش adp برای سنجش واکنش های آنزیمی با دنبال کردن تشکیل یا مصرفadp استفاده می شود. تاکنون چندین روش برای سنجش adpراه اندازی شده است. یکی از این روش ها بر اساس تبدیل یک به یک adp به atp توسط آنزیم پیروات کیناز، در حضور مقادیر مختلف adp و به دنبال آن اندازه گیری atp تشکیل شده توسط لوسیفرین-لوسیفراز می-باشد. با توجه به نقش کلیدی آنزیم پیروات کیناز (ec 2.7.1.40) در این سنجش ژن کدکننده این آنزیم از باکتری گرمادوست ژئوباسیلوس، در ناقل بیانی pet28-a (+) و باکتری اشریشیاکولی bl-21، کلون، تعیین توالی و بیان شد. این ژن به طول 1764 جفت باز توانایی کدکردن پروتئینی به طول 587 باقیمانده اسید آمینه را دارد. توالی نوکلئوتیدی ژن پیروات کیناز و توالی آمینواسیدی آن %100 مشابه آنزیم پیروات کیناز geobacillus kaustophilus hta426 می باشد. پروتئین نوترکیب به روش کروماتوگرافی تمایلی خالص سازی شد. آنزیم خالص سازی شده برای اندازه گیری adp به روش واکنش جفت شده توسط بیولومینسانس استفاده شد. ویژگی های بیوشیمیایی از قبیل پارامترهای سینتیکی، اثر دما بر پایداری آنزیم، اثر ph و نیز مطالعات ساختاری cd بررسی شد. پارامترهای سینتیکی نشان داد که این آنزیم نسبت به سوبسترای pep، فرآیند تعاونی مثبت هموتروپیک با k0.5 برابر 3/1 میلی مولار اما برای adp با سینتیک میکائیلیس- منتن با km برابر2 میلی مولار با ماکزیم فعالیت در ph برابر با 5/7 و دمای 65 درجه سانتیگراد می باشد.