بررسی بیوشیمیایی و بهینه سازی تولید لاکاز و تایروزیناز توسط نیوروسپورا کراسا
چکیده
چکیده نیاز روزافزون بشر به فناوری های اکسایشی که در عین کارآمدی آسیب زننده به محیط زیست هم نباشند، توجه همگان را به استفاده از آنزیم های اکسید کننده معطوف نموده است. در این بین آنزیم های تایروزیناز و لاکاز به واسطه استفاده از هوا و تولید آب در واکنش های اکسایشی خود، از اهمیت ویژه ای برخوردارند و آنزیم های سبز نام گرفته اند. در این تحقیق تولید همزمان تایروزیناز و لاکاز توسط قارچ رشته ای نیوروسپورا کراسا سویه های fgsc #321 و fgsc #7431 بررسی شد. سویه دوم به دلیل ناتوانی در ایجاد کنیدی و به تبع آن عدم امکان دست یابی به شرایط پایدار و تکرارپذیر رشد و تولید آنزیم، از مطالعات بهینه سازی کنار گذاشته شد. تولید هر دو آنزیم در مرحله رویشی نیوروسپورا کراسا سازوکار القایی دارد و مزیت عمده این قارچ تولید تایروزیناز به صورت درون سلولی و ترشح لاکاز به خارج سلول می باشد. با در نظر گرفتن کامل ادبیات علمی در این زمینه، ابتدا شرایط رشدی سویه به منظور دست یابی به بیشترین میزان زیست توده قارچی با استفاده از یک آرایه متعامد 9 lبه روش تاگوچی بهینه سازی شد. سپس بهینه سازی شرایط القا با بررسی سطوح مختلف عوامل موثر بر تولید آنزیم لاکاز، به صورت جداگانه و ترکیبی انجام شد. در ادامه تلاش شد تا تحت شرایط بهینه تولید لاکاز، با تغییر ملایم عوامل القا تولید تایروزیناز نیز به حد قابل قبولی برسد. با رشد سویه در شرایط بهینه: محیط کشت پایه ووگل با 5/2% ساکارز، درجه حرارت c? 25، ph اولیه محیط 5/6 و دوره رشدی 6 روزه (144 ساعت) در حالت ساکن و بدون نیاز به هم زدن یا تهویه، بازده رشد نسبت به شرایط گزارش شده قبلی تا 5/2 برابر افزایش یافت. بیشترین میزان تولید همزمان آنزیم های تایروزیناز و لاکاز با انتقال سلول های قارچ به بافر فسفات شامل ?m 2 سیکلوهگزیمید وmm 2 فلورویوراسیل در دمای c? 30 انجام شد. جالب توجه است که در شرایط تنش قحطی در بافر فسفات همراه با تغییر دما از 25 به c? 30 هر دو آنزیم به میزان قابل توجهی تولید می شدند. تفاوت بازده در این دو حالت تنها در حدود 10% بود که با در نظر گرفتن هزینه بالای القاکننده های شیمیایی، قابل تأمل می باشد. همچنین نمونه نسبتاً خالصی از آنزیم لاکاز تولید شده تهیه گردید و مشخصات سینتیکی و بیوشیمیایی آن به کمک یک روش سنجش اسپکتروفتومتری مستقیم با استفاده از مشتقات دی آزوئه گوآیاکل که برای مطالعه دقیق و صحیح لاکاز در طی همین تحقیق ارائه شد، مورد بررسی قرار گرفت. در نهایت نیز، نظر به اهمیت بهبود قابلیت های کاربردی لاکاز، مطالعات مولکولی تکامل هدایت شده (directed evolution) لاکاز mtlr2-23 با هدف تغییر دامنه ph فعالیت آن انجام شد.