انتقال ژن فعال کننده پلاسمینوژن بافتی انسانی(tpa) به سلول های گیاه خیار .cucumis sativus l با روش اگروباکتریوم
چکیده
امروزه کشاورزی مولکولی پتانسیل بالایی در تولید نامحدود واکسنها، آنتیبادیها، پروتئینهای دارویی، عامل های رشد و آنزیمها دارد. فعال کننده پلاسمینوژن بافتی (tpa)، سرین پروتئازی است که نقش مهمی در سیستم فیبرینولیتیک و انحلال لخته های فیبرین در انسان دارد و به طور عمده در کبد و جداره رگ های خونی سنتز می شود. در بین سیستمهای موجود انتقال ژن، انتقال توسط اگروباکتریوم به عنوان یک روش مناسب برای الحاق پایدار ژنها به ژنوم گیاه به شمار میرود. این در حالی است که انتقال ژن توسط اگروباکتریوم هنوز در برخی گونه های گیاهی سرسخت از جمله خیار (cucumis sativus l.) با مشکل مواجه است. خیار یکی از مهمترین محصولات صیفی جهان می باشد که در بین سبزی های مهم، مقام چهارم را دارا است. در این مطالعه، ابتدا به منظور بررسی باززایی مناسب گیاه خیار واریته اصفهان، از شش تیمار هورمونی استفاده شد. سپس، ژن tpa انسانی که تحت پیشبرنده camv 35s توسط گروه بیوتکنولوژی دانشکده کشاورزی دانشگاه تربیت مدرس در پلاسمید pbi121 کلون شده بود به اگروباکتریوم سویه lba4404 منتقل گردید و به وسیله colony pcr با آغازگرهای اختصاصی تأیید گشت. به منظور انتقال ژن tpa، ریزنمونه های خیار، توسط اگروباکتریوم lba4404 حاوی سازه pbi121-tpa تلقیح شده و پس از هم کشتی، به محیط گزینشگر شامل آنتی بیوتیک های کانامایسین و سفوتاکسیم منتقل شدند. گیاهان باززا شده بر روی محیط گزینشگر، پس از تولید نوساقه به ترتیب به محیط ریشه زایی و کوکوپیت منتقل شدند. بررسی این گیاهان در سه سطح dna، rna و پروتئین انجام پذیرفت. تراریخته بودن گیاهان حاصل، توسط آغازگرهای اختصاصی و با کمک واکنش pcr مورد تأیید قرار گرفت. به منظور بررسی بیان ژن tpa در گیاهان تراریخته، rna استخراج و آزمون rt-pcr رونویسی ژن tpa را در آن ها تأیید کرد. به منظور بررسی تولید پروتئین tpa نوترکیب، پس از استخراج پروتئین از برگ، از آزمون های dot-blot و sds-page استفاده و حضور پروتئین tpa در گیاهان تأیید گشت. برای سنجش میزان پروتئین tpa نوترکیب در گیاهان خیار تراریخته، از آزمون elisa استفاده شد.