ساخت سازه های پلاسمیدی مناسب جهت بیان اختصاصی بافت و بررسی بیان موقت ژن با استفاده از سیستم اگرواینفیلتریشن
چکیده
پیشبرها یکی از عناصر کلیدی مهندسی ژنتیک برای بیان هدفمند ژن ها محسوب می شوند.پیشبرهایe8و2a11پیشبرهای ویژه بافت میوه گیاه گوجه فرنگی می باشند.e8یک ژن مرتبط با بیوسنتز اتیلن است. پروتیین e8عضوی از خانواده دی اکسیژنازها و مربوط به 1-آمینوسیکلوپروپان 1-کربوکسیلیک اکسیداز است که مرحله آخر مسیر بیوسنتز اتیلن را کاتالیز می کند.ژن 2a11نیز در میوه بیان می شود. mrna،2a11ابتدا در تخمدان و در مرحله شکفتگی کامل گل کشف شد که تا 1 درصد از کل جمعیت mrnaتجمع یافته در طی رسیدگی میوه را تشکیل می دهند.به منظور بیان اختصاصی ژن در غده های سیب زمینی عمومی ترین پیشبر مورد استفاده پیشبرpatatinاست.پاتاتین ها گروهی از گلیکوپروتیین ها هستند که به وسیله یک خانواده چند ژنی رمزسازی می شوند.این پروتیین ها بیش از 40 درصدپروتیین های محلول در غده سیب زمینی را به خود اختصاص می دهند.پیشبرکلاس i بطور عمده مسئول بیان پاتاتین های غده بوده و بنابراین الگوی بیان اختصاصی برای غده را داشته و در بخش بافت پارانشیمی غده به مقدار زیاد وجود دارند.هدف از این تحقیق همسانه سازی پیشبرهای اختصاصی میوه(e8و 2a11) و پیشبر اختصاصی غده(پاتاتین کلاس i یا pat1)، و بررسی بیان اختصاصی آن می باشد.پس از استخراج dnaیژنومی از گیاهان گوجه-فرنگی وسیب زمینی پیشبرهای e8، 2a11و pat1با استفاده از پرایمرهای اختصاصی هر یک از پیشبرها، در ناقل همسانه ساز ptz57r/t همسانه سازی شدند.سپس پلاسمیدهای نوترکیب در باکتری e. coliسویهxl1blue تراریخت گردیدند و سلول هایlacz?غربال شدند.قطعه-های مورد نظر با دو آنزیم برشی hindiiiو bamhiجدا و خالص سازی شدندسپس جایگزین پیشبر دایمی camv35sدر ناقل دوگانه pbi121گردیدند.ناقل دوگانه pbi121با دارا بودن ناحیهt-dna، حاوی ژن گزارش گر گاس وپیشبرcamv35sواجد مشخصات لازم جهت استفاده برای انتقال ژن از طریقاگرواینفیلتریشن به گیاه بود و به همین دلیل به عنوان ناقل هدف جهت کلون سازیپیشبرهایe82a11و pat1و ژنhbsagانتخاب شد.پلاسمیدهای نوترکیب به روش شوک حرارتی بهسویه lba4404agrobacterium tumefaciensمنتقل گردیدند.با استفاده از روش اگرواینفیلتریشن بیان اختصاصی ژن گاسدر بافت های گیاهان گوجه فرنگی وسیب زمینی مورد بررسی قرار گرفت.نتایج حاصل نشان داد که در مقایسه با پیشبر camv35s، پیشبرهای e8، 2a11و pat1نیز با کارایی بالایی باعث بیان ژن گاس در میوه ها و غده-هامی شوند.پس از تایید پلاسمیدهای نوترکیب، ژن hbsagبا دو آنزیم bamhiو saciاز ناقل pma-t جدا شد و تحت کنترل پیشبر عمومی camv35sو پیشبرهای e8،2a11وpat1جایگزین ژنگاس در ناقل دوگانهpbi121گردید.سپس پلاسمیدهای نوترکیب در سویهxl1blueباکتری e. coliتراریخت شدند.با هضم آنزیمی حضور ژن hbsagتایید شد.