ساخت سازه و بیان موقت پروتئین گزارشگر ترشحی mgfp5-er با استفاده از آگروباکتریوم در گیاه توتون
چکیده
ژن گزارشگر gfp به منظوربهینه سازی سیستم انتقال ژن در مهندسی ژنتیک کاربرد فراوان دارد. ویژگی های منحصر به فرد این پروتئین باعث شده است تا gfp بیش از هر گزارشگر دیگری در مطالعات ملکولی استفاده شود. gfp هنگامی که بوسیله نور فرابنفش یا آبی برانگیخته شود، نور سبز قابل رویت از خود ساطع می کند.این پروتئینپایدار است و تابش رنگی آن از طریق یک سیکل خودکاتالیزوری درونی ایجاد میگردد که نیازمند هیچ کوفاکتور یا سوبسترایی نیست.یکی از نسخه های اصلاح شده gfpکه به طور صحیح در گیاهان بیان شده، پروتئین mgfp5-er است. توالی سیگنال ترشحی ناحیه n-terminal، سبب ورود آن به مسیر ترشحی سلول می شود.ترشحی بودن یک پروتئین امکان بازیافت آن از آب میان بافتی مواد گیاهی تراریختهرا به سادگی و با کمترین هزینه فراهم میکند.در این پژوهش توالی کدکننده پروتئینmgfp5-er در ناقل بیان گیاهی pbi121 تحت کنترل پیش برنده camv35s و خاتمه دهنده nos همسانه سازی شد. پلاسمید ناقل دوگانه نوترکیب pbi-mgfp5-er با استفاده از تکنیک های pcr و هضم آنزیمی مورد تایید قرار گرفت. سازه ی تهیه شده pbi-mgfp5-er با استفاده از روش ذوب و انجماد به آگروباکتریوم تومفاشینس سویه های lba4404 و gv3850 انتقال داده شد و با استفاده از روش دیسک برگی در ژنوم گیاه توتون ادغام شد. انتخاب اولیه سلولهای تراریخته گیاه توتون برروی محیط حاوی کانامایسین صورت پذیرفت .واکنش زنجیره ای پلیمراز بااستفاده ازآغازگرهای اختصاصی بر روی dnaژنومی سلول های گیاهی تراریخته وهمچنین مشاهده سیگنال فلورسانس mgfp5-er تحت تابش نور uv365nm، انتقال ژن mgfp5-er به گیاه توتون را اثبات نمود.