بیان آنتی بادی اختصاصی علیه پروتئین غشایی (immunodominant membrane protein) عامل جاروک لیموترش در گیاه توتون
چکیده
بیماری جاروک لیموترش توسط candidatus phytoplasma aurantifolia ایجاد شده و یکی از مخرب ترین بیماری های لیموترش در مناطق گرم جنوبی کشور به شمار می رود و سالیانه هزاران درخت را نابود می کند. روش های قدیمی از قبیل حذف درختان آلوده و کنترل حشره ناقل قابلیت محدودی در مدیریت بیماری دارند. امروزه بیوتکنولوژی مولکولی روش های جدید و موثری برای کنترل بیمارگرها در گیاهان فراهم کرده که امکان تولید گیاهان تراریخت مقاوم به فیتوپلاسما یکی از این موارد می باشد. تولید گیاه مقاوم به بیمارگر با کمک آنتی بادی، بر اساس بیان آنتی بادی های نوترکیب متصل شونده به پروتئین های ضروری و حیاتی بیمارگر و جلوگیری از گسترش آن در گیاه است. در مطالعه حاضر تولید و تعیین خصوصیات آنتی بادی های نوترکیب scfv اختصاصی علیه پروتئین غشایی فیتوپلاسمای عامل جاروک لیموترش انجام گرفت. پروتئین immunodominant membrane protein (imp) در سطح غشاء فیتوپلاسما قرار دارد و نقش ضروری در ایجاد بیماری بیمارگر در گیاه میزبان و حشره ناقل (hishimonus phycitis) دارد. در این تحقیق ژن رمزکننده imp عامل بیماری جاروک لیموترش با استفاده از آغازگرهای اختصاصی تکثیر گردید. سپس ژن مورد نظر در ناقل بیانی pet28a همسانه سازی شد و پروتئین نوترکیب در باکتری e. coli سویه bl21 بیان گردید. خالص سازی پروتئین در شرایط طبیعی با روش کروماتوگرافی تمایلی انجام شد. بیان موفق و مراحل خالص سازی به وسیله sds-page و سپس آنالیز وسترن بلات تأیید گردید. پروتئین نوترکیب برای ایمنی زایی خرگوش و تولید آنتی بادی چند همسانه ای اختصاصی و همچنین غربالگری کتابخانه-های نمایش فاژی جهت تهیه آنتی بادی های نوترکیب single-chain variable fragment (scfv) استفاده شد. پس از خالص سازی آنتی سرم حاصل از خرگوش، آنتی بادی با آنزیم آلکالین فسفاتاز نشاندار شد. نتایج آزمایش های سرولوژیکی بلاتینگ و das-elisa موید کارکرد موثر و دقیق آنتی بادی پلی کلونال تولید شده برای شناسایی فیتوپلاسمای عامل بیماری جاروک لیمو ترش بود. تکنیک نمایش فاژی امکان انتخاب آنتی-بادی های نوترکیب ویژه علیه یک آنتی ژن خاص را فراهم کرده است. پروتئین imp نوترکیب جهت پنینگ کتابخانه های نمایش فاژیtomlinson i&j استفاده شد و در نهایت 96 کلنی انتخاب و توانایی تولید آنتی بادی نوترکیب ( scfv) توسط آنها با آزمون های الایزا و ایمنوبلات بررسی شد. آنتی بادی های نوترکیب تولید شده در آزمون الایزا جهت شناسایی نمونه های گیاهی آلوده به جاروک لیموترش و پروتئین imp نوترکیب استفاده گردید و اختصاصی بودن آنتی باد های نوترکیب منتخب تأیید شد. در نهایت ژن آنتی بادی نوترکیب scfvimp6 که اختصاصیت و قابلیت اتصال بالا به پروتئین imp داشت، برای بیان موقت در گیاه nicotiana benthamiana انتخاب شد. ژن رمزکننده این آنتی بادی در ناقل بیانی گیاهی (ptra) تحت کنترل پروموتر دائمیcauliflower mosaic virus (camv) 35s یا پروموترcoconut foliar decay virus (cfdv) اختصاصی آوند آبکش در سازه های ژنی با یا بدون سیگنال پپتید قرار گرفت و بیان پروتئین در سیتوسول یا آپوپلاست سلول گیاهی بررسی شد. سازه های ژنی با agroinfiltration در گیاه n. benthamiana به صورت موقت بیان شدند. در آنالیزهای ایمونوبلات آنتی بادی هایی با اندازه پیش-بینی شده ردیابی شد. آنتی بادی های بیان شده در گیاه با کروماتوگرافی تمایلی خالص سازی شدند و توانایی اتصال آن ها به imp با آزمون الایزا تأیید گردید. نتایح این مطالعه نشان داد که با کارایی و پایداری مشاهده شده در بیان موقت، به نظر می رسد که آنتی بادی scfv حاصل می تواند پس از انتقال پایدار به گیاه لیموترش به خوبی بیان شود و کاندیدای مناسبی برای ممانعت از بیماری جاروک در گیاه باشد.