بررسی تنوع ژنتیکی ریزوبیوم های همزیست با شبدر در ایران
چکیده
به منظور بررسی روابط ژنتیکی جمعیت جدایه های rhizobium leguminosarum bv. trifolii همزیست با گونه های مختلف شبدر در خاک مناطق جغرافیایی مختلف، نمونه های خاک از هفت منطقه کشور شامل استان های لرستان، اصفهان، خراسان، همدان، کرمانشاه، کردستان و آذربایجان غربی. جمع آوری گردید و بذور سه گونه شبدر مصری، شبدر ایرانی و شبدر قرمز در خاک مناطق مذکور کاشته شد. به این ترتیب 21 گلدان با ترکیبات مختلف خاک-گونه گیاهی به منظور بررسی رابطه متقابل نژاد ریزوبیوم-گونه شبدر و منطقه جغرافیایی آماده گردید و در گلخانه نگهداری شد. پس از رشد گیاهان و تشکیل گره در ریشه ها، جدای های ریزوبیوم همزیست از این گره ها جداسازی و خالص شد که شامل 420 جدایه برای کل تیمارهای شبدر-منطقه بود. تنوع ژنتیکی جدایه های ریزوبیومی همزیست سه گونه شبدر در خاک هفت منطقه مذکور و رابطه متقابل خاک منطقه، گونه شبدر میزبان و ریزوبیوم همزیست با استفاده از روش انگشت نگاری rep-pcr با استفاده از آغازگر boxair در طی سه مرحله بررسی گردید. در مرحله اول، تنوع ژنتیکی جدایه های بدست آمده از خاک هر منطقه، در مرحله بعدی اختلاف الگوی dna جدایه های مربوط به سه گونه مختلف شبدر در یک خاک مشخص مطالعه شد و در نهایت نیز ایزوله های جدا شده از گونه های مختلف، در مقایسه دو به دوی خاک ها مورد بررسی قرار گرفتند. تعداد و فراوانی جدایه های مورد بررسی، در هر یک از این مراحل به کمک دو شاخص فراوانی نژادی strain richness و غالبیت نژادی strain dominance تعیین گردید. از میان 21 تیمار مختلف مورد بررسی، تیمار خاک نطنز -شبدر ایرانی با شاخص فراوانی برابر با 62/0 بیشترین تنوع را نشان داد. همچنین نمونه خاک مربوط به استان کرمانشاه با فراوانی نژادی 33/0 دارای فراوان ترین تیپ نژادی و خاک لرستان با فراوانی نژادی 12/0 دارای کمترین فراوانی در میان هفت خاک مورد بررسی شناخته شد. مقدار فراوانی نژادی برای سه گونه شبدر قرمز، شبدر ایرانی و شبدر مصری نیز به ترتیب برابر با 3/.، 28/0 و 23/0 به دست آمد. در این تحقیق از میان 152 ایزوله مورد بررسی، 23 نژاد مختلف در ارتباط با سه گونه شبدر در خاک های تحت مطالعه شناسایی شد. در میان نژادهای شناسایی شده، نژاد شماره 9 با شاخص فراوانی 16/0 دارای بالاترین غالبیت نژادی بود. با استفاده از داده های حاصل از انگشت نگاری مبتنی بر box-pcr، فواصل ژنتیکی نژادهای شناسایی شده با استفاده از ضریب تشابه جاکارد و روش upgma در نرم افزار ntsys 2.0 بررسی شد. اگر چه مقایسه الگوهای انگشت نگاری تنوع بالایی را میان جدایه های مورد بررسی نشان داد، اما مقایسه ضرایب تشابه به دست آمده و دندو گرام مربوط، رابطه خاصی را میان نژاد باکتری، نوع گونه شبدر و خاک منطقه نشان نداد. به منظور تعیین روابط فیلوژنی شناسایی شده در این تحقیق از تکنیک pcr-rflp بر روی ژن reca استفاده گردید. نتایج بدست آمده تفاوتی را میان نژادهای مورد مطالعه نشان نداد. آزمون های تولید ملانین و مقاومت به شوری به منظور بررسی قدرت رقابت نژادهای شناسایی شده نشان داد که هیچ یک از جدایه ها دارای توانایی تولید ملانین نبوده و نسبت به درجات بالای شوری مقاوم نمی باشند. همچنین 23 نژاد شناسایی شده در این تحقیق به منظور ردیابی ژن های تجزیه کننده ریزوبین (moc) استفاده از آغازگرهای mocdef/mocder بررسی گردیدند. نتایج این آزمون نیز نشان داد که هیچ یک از جدایه های مورد بررسی در این پژوهش ژن های تولید و تجزیه ریزوبین را ندارند و دارای قدرت رقابتی قابل توجهی نسبت به سایر جدایه ها نمی باشند.