طراحی، سنتز نوترکیب و بیان پپتید دارویی mbp8298 در باکتری escherichia coli
چکیده
چکیده در سال های اخیر تولید مولکول های پپتیدی به دلیل نقش اساسی آنها در فرایندهای رشد و تمایز سلول های گیاهی و جانوری و همچنین اهمیت دارویی و تجاری مورد توجه روزافزون بوده است. تولید پپتید هایی با مقادیر زیاد و خلوص بالا که به منظور مطالعات in vitro، کنترل فیزیولوژی سلولی یا به عنوان دارو مد نظر هستند به دو شیوه ی سنتز شیمیایی و بیان تراریختی انجام می پذیرد. از آنجا که بیان مستقیم پپتید های کوچک در سیستم های باکتریائی عمدتاً با شکست مواجه می شود، معمولاً با اتصال واحد های پپتیدی به یکدیگر یا اتصال توالی پپتید مورد نظر به یک توالی الحاقی (موسوم به "شریک الحاق")، می توان احتمال موفقیت بیان این دسته از مولکول ها را افزایش داد. در تحقیق حاضر پپتید 17-اسیدآمینه ای mbp8298 به عنوان یک مدل برای بیان در باکتری escherichia coli انتخاب شد. توالی dna کد کننده پلی پپتید mbp8298 با توجه به ردیف اسیدهای آمینه، ترجیح کدونی، تشکیل ساختار ثانویه ی مطلوب برای مولکول mrna، لحاظ جایگاه های برشی مناسب در توالی dna و جایگاه شکست در پلی پپتید نهایی، طراحی و تهیه گردید. برای افزایش احتمال بیان mbp8298، اتصال دو شریک الحاق، یکی پپتیدی موسوم به توالی پائولوس و دیگری پروتئین یوبی-کویتین نیز مد نظر قرار گرفت. توالی پائولوس به ترتیب ذکر شده در فوق و با لحاظ جایگاه های برشی مناسب با استفاده از روشهای سنتز ژن تهیه گردید و بالاخره دستواره ی سنتتیک pm2h (شامل شریک الحاق پائولوس، دایمر mbp8298 و توالی برچسبی 6his برای تخلیص نهائی پروتئین تراریختی) در ناقل بیانی pet-21c(+) همسانه سازی شد. توالی پائولوس که به منظور بهینه سازی آغاز ترجمه در بالا دست این دستواره تعبیه شده بود، بعد از کدون آغاز مشتمل بر یک توالی غنی ازنوکلئوتید های au و یک ساختار ساقه-حلقه (در مولکول mrna) بود. دستواره ی um2h که بجای شریک الحاق پائولوس دارای قطعه ی orf یوبی کوئیتین (جداسازی شده از گیاه medicago truncatula) بود نیز به همین طریق ساخته-شد و بالاخره به منظور مقایسه، دستواره ی سومی موسوم به m2h که فاقد شریک الحاق بود نیز ساخته شد. سه دستواره ی مذکور پس از توالی یابی به میزبان بیانی bl21(de3) منتقل و برای بیان پروتئین ترکیبی مورد نظر با iptg القاء شدند و میزان بیان پروتئین های تراریخت با استفاده از ژل sds-page مشاهده گردید. پروتئین های تراریخت um2h و pm2h به ترتیب در بخش مایع و اجسام متراکم باکتری مشاهده شدند. در حالی که پروتئین تراریخت m2h بر روی ژل مشاهده نشد. پروتئین های الحاقی تولید شده با کمک کروماتوگرافی جذبی بر روی ستون ni-nta با موفقیت خالص سازی شدند. در پایان نتیجه گیری شد که هر دو شریک الحاق پائولوس و یوبی کوئیتین سبب بیان بالای mbp8298 می شوند، در حالی که در غیاب آنها بیان پپتید مشاهده نمی شود. همچنین توالی پائولوس منجر به بیان محصول به صورت اجسام نامحلول و توالی یوبی کوئیتین منتهی به بیان محصول به صورت محلول می گردد. وجود و عملکرد برچسب 6his نشان می دهد که توالی پروتئین های مذکور با توالی مورد انتظار این ژن ها مطابقت دارد. این، اولین گزارش از بیان تراریختی پپتید دارویی mbp8298 می باشد.