مطالعه بیان آنزیم لیپاز جدا شده از باکتری بی هوازی thermoanerobacter thermohydrosulfuricus در باکتری escherichia coli
چکیده
در پژوهش حاضر هدف افزودن پپتید راهنما آنزیم متالوپرتئاز svp2 جدا شده از یک باکتری نمک دوست نسبی به ابتدای ژن آنزیم لیپاز ترموفیل و مقاوم به حلال های آلی، جدا شده از باکتری بی هوازی thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus ، می باشد. بدین منظور دو جفت پرایمر با نام های ft، rt و rsp، fsp برای تکثیر قطعات ژنی مربوط به قطعه پپتید نشانه و آنزیم ttl طراحی گردید و pcr انجام شد. ابتدا قطعه ژن تکثیر شده ttl که حاوی توالی های آداپتور جایگاه برش آنزیم های برشگر saci و hindiii بود، در پلاسمید pqe 80l کلون و پلاسمید حاصل pqe 80l-ttl نام گذاری گردید. سپس قطعه تکثیر شده مربوط به پپتید راهنما که حاوی توالی آداپتور جایگاه برش آنزیم های برشگر saci و ecori بود در پلاسمید pqe 80l-ttl کلون و ساختار نهایی pqe 80l-ttl-sig ساخته شد. مطالعه بیان خارج سلولی آنزیم ttl در باکتری e.coli نوترکیب نشان داد که عمده فرم فعال آنزیم در فضای پری پلاسمیک قرار می گیرد. در نتیجه به کمک آنالیز های آماری فاکتوریل جزئی، پاسخ سطحی و مطالعه اثر عوامل مختلف شامل گلایسین، تریتون ایکس 100، غلظت iptg، زمان قبل و پس از تیمار با iptg، دمای گرمادهی پس از تیمار و غلظت عصاره مخمر محیط کشت مشخص گردید که شرایط بهینه بیان و ترشح آنزیم ttl به محیط، تیمار با غلظت 27/1 درصد گلایسین و زمان تیمار 24 ساعت می باشد. در نهایت مطالعه خصوصیات بیوشیمیایی آنزیم ttl نوترکیب حاصل بررسی و دما و ph بهینه فعالیت آنزیم به ترتیب 65 درجه سانتیگراد و 5/7 تعیین گردید.