کلونینگ و بیان آنزیم محدودکننده ی xcmi در باکتری e .coli
چکیده
آنزیم های محدودکننده توالی خاصی از dna را شناسایی می کنند و اسکلت قند-فسفات dna را در آن یا نزدیکی آن برش می زنند. این آنزیم ها اکثرا منشا باکتریایی دارند و در سامانه ی اصلاح و برش باکتری ایفای نقش می کنند. آنزیم های محدودکننده در همسانه سازی ژن-ها و مهندسی ژنتیک نقش اصلی را ایفا می کنند و بسیاری تکنیک-های مولکولی دیگر نیز بر پایه ی توانایی آن ها در برش دادن توالی های اختصاصی از dna تعریف شده است. در این مطالعه آنزیم محدودکننده ی xcm(i) از باکتری xanthomonas campestris در باکتری e. coli همسانه سازی و بیان شد. آنزیم xcmi جایگاه اختصاصی ggtnnnnnnnnnacc راشناسایی کرده و برش می زند و انتهای چسبنده ی t تولید می کند، توانایی آنزیم محدودکننده ی xcmi در تولید انتهای چسبنده یt بعد از برش dna، موجب ظهور تکنولوژی ta-کلونینگ شده است. برای تولید آنزیم محدودکننده ی xcmi ژن کدکننده ی آنزیم محدودکننده ی xcmi سنتز شد و در وکتور pet26b(+) قرار گرفت، حاملpet26b در باکتری میزبان e. coli بیان و آنزیم xcmi در e. coli تولید شد. بیان در سیستم بیانی pet26b تماما به صورت جسم توده ای بود، برای حصول پروتئین محلول با فولدینگ صحیح سیگنال ترشحی پروتئینa با تکنیک overlapping pcr به ژن کدکننده ی آنزیم اتصال یافت که در این قسمت پروتئین بیان نشد در مرحله ی بعد ژن آنزیم محدودکننده ی xcmi با همسانه سازی شدن در حامل pgex-4t-2 به پروتئین فوق العاده محلول gstمتصل شد و بخشی از پروتئین به صورت محلول بیان شد. آنزیم محلول متصل به gst به کمک bead های گلوتاتیون خالص سازی شد. در ادامه آنزیم به کمک پروتئاز از پروتئین gst جدا شد و فعالیت آن بررسی شد که فاقد فعالیت بود. در ادامه ی کار برای حصول پروتئین محلول از آنزیم همسانه سازی شده در pet26b به باکتری میزبان حامل pet26b شوک حرارتی داده شد. با بهره گیری از این روش مقداری از پروتئین به صورت محلول بیان شد و با bead های نیکل خالص سازی شد و پس از تعیین غلظت با نانودراپ فعالیت آن مورد بررسی قرار گرفت که تنها فعالیتی جزئی از آنزیم مشاهده شد. آنزیم xcmi توانایی دایمریزه شدن نداشت و به صورت مونومر عمل کرد و تنها در پلاسمید سوبسترا ایجاد nick کرد.